烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W estern b lot检测结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。

云南烟草蚀纹病毒与其他病毒复合侵染的多重RT-PCR检测

烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)在云南各烟区普遍发生,且症状表型不一,TEV与其他病毒复合侵染,给烟草病毒病防治带来困难。病毒的准确检测是病害防控的前提。本文应用多重RT-PCR检测云南烟草病毒病样品,发现TEV与其他病毒存在3种复合侵染类型,分别为TEV/TVBMV,TEV/TMV和TEV/TVBMV/PVY。其中,TEV单独侵染只占检测样品数目的 19.05%,而TEV/TVBMV复合侵染发生较为普遍,占检测样品数目的 52.38%。初步分析了这3种复合侵染类型在云南烟草产区的分布,其中最主要的复合侵染类型TEV/TVBMV在文山、楚雄、昭通和昆明4个州市不同烟区分布广泛。该试验结果为云南TEV的监控与防治提供了理论依据。

烟草蚀纹病毒(TEV)生物学及理化特性的研究

从自然感病的烟草上分离到烟草蚀纹病毒(TEV)。其寄主范围较宽,经汁液摩擦接种普通烟产生明脉和坏死性蚀纹,在蔓陀萝上为斑驳和畸形,不侵染苋科的千日红及豆科和葫芦科植物。致死温度为53℃,稀释限点为3×10^(-3),体外保毒期为4天。蚜虫传毒试验表明,可经桃蚜进行非持久性传毒。粗提纯的病毒制品在电镜下为稍弯曲的线状粒子,大小约728×12-13nm。病毒粒子经5-40％的蔗糖密度梯度离心后,显示出单一主峰,其紫外吸收值最大为258.5nm,最小为241.7nm,A280/260之比值为1.27。降解病毒所得核酸和蛋白的紫外吸收值分别为最大258nm及273.9nm,最小为233nm及250nm,经PAGE测定其分子量分别为3.16×10~6道尔顿及2.98×10~4道尔顿。用提纯病毒制备所得抗血清效价为1:512;经琼脂双扩散试验证明只与分离的病毒起沉淀反应,而与CMV、TMV、ToRSV、TNV、PVY则无反应。

渭北烟区烟草蚀纹病毒和黄瓜花叶病毒侵染循环的研究

用酶联免疫吸附实验(ELISA)对渭北烟区6科18种植物461个病毒标样的 TEV 和 CMV检测,对蚜虫种类,主要传毒蚜虫发生规律、蚜虫传毒测定以及烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草黄瓜花叶病毒(CMV)的侵染循环进行了调查研究。结果表明,TEV 的自然寄主有辣椒、番茄、龙葵、蔓陀罗、酸浆以及刺儿菜和菠菜,刺儿菜是主要越冬寄主;CMV 的寄主有辣椒、番茄、豇豆、菜豆以及油菜、萝卜(留种)、菠菜、刺儿菜,其中油菜是主要越冬寄主。越冬后的 TEV 和 CMV 通过有翅蚜虫(主要是桃蚜)传给烟草、辣椒、番茄等蔬菜以及杂草,秋季又通过有翅蚜虫传给越冬寄主。

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法获得烟草蚀纹病毒(TEV)外壳蛋白(CP)基因,大小为789bp。经过EcoRI和Not Ⅰ双酶切、定向克隆到pPIC9K,构建了真核表达载体pPIC9K-TEVCP。将重组质粒用Sal I线性化后电转化导入毕赤酵母GS115中,经PCR鉴定为阳性的菌落,利用甲醇进行诱导表达,筛选出了高效表达菌株GS115-11和GS115-14,表达的蛋白大小约为37kD。表达产物经SDS-PAGE割胶纯化后,免疫家兔,制备了特异性抗血清,ELISA法检测效价为1:1500。Western blot结果显示,制备的抗血清可以用来检测田间的发病植株。

侵染辣椒的烟草蚀纹病毒的鉴定

1990年在杨陵从表现花叶畸形的辣椒上分离到H90-2分离物。汁液摩擦接种6科17种植物,病毒可侵染2科8种植物,在白肋烟、三生烟上出现坏死蚀纹,在辣椒、心叶烟、曼陀罗上出现花叶畸形,在苋色藜上出现局部枯斑。该分离物的致死温度为50—55℃,稀释限点10^(-3)×10^(-3),体外保毒期3—5天,桃蚜可传毒。病毒粒体为线状,稍弯曲,长720—750nm,宽13nm,与烟草蚀纹病毒的抗血清有明显的阳性反应。根据这些特性,经初步鉴定该病毒属于马铃薯Y病毒组的烟草蚀纹病毒(TEV)。

蚜虫传播烟草蚀纹病毒的研究

提纯了烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus TEV),并用人工薄膜饲毒作了蚜虫传毒试验,同时调查了渭北烟草区传毒蚜虫种类,以及蚜虫消长与烟田蚀纹病发生的关系。结果表明,该烟草区主要有桃蚜、萝卜蚜、甘蓝蚜、麦二叉蚜、麦长管蚜以及棉蚜等;传毒试验表明,仅桃蚜能传播TEV;在烟田TEV的发生与有翅蚜虫消长有一定的相关性。

烟草蚀纹病毒弱株系的研究

1991～1995年利用钴60照射和亚硝酸处理进行了烟草蚀纹病毒（TEV）弱株系的选择及防病效果试验。结果表明，钴60照射病毒溶液能产生弱株突变体的适宜剂量是1．29C／kg和2．58C／kg，亚硝酸处理的适宜浓度和时间是1mol／L，30min～50min。以选择效果明显的弱株有R4和H38，其室内交互保护试验的效果最高值分别是85．8％和47．4％，田间防病效果分别为81．6％和40．3％。两个弱株免疫后接种强株，其烟株体内病毒含量均低于强株对照。试验还表明，亚硝酸处理较钻60能产生较多的弱株突变体。

四川烟草蚀纹病毒病(TEV)的发生及其防控措施

烟草蚀纹病毒病(Tobacco etch virus,简称TEV)是由蚀纹病毒引起的一种烟草病毒病害,该病主要发生在烟株旺长以后,茎、叶均可受害。近年来我省各烟区的烟草蚀纹病毒病均有加重为害的趋势。本文主要介绍了烟草蚀纹病毒病的症状特点、发生规律与流行条件以及综合防控技术。

烟草蚀纹病毒对玉米矮花叶病防治效果的研究

为了研究烟草蚀纹病毒(Tobaccoetch virus,TEV)对玉米矮花叶病(病原为甘蔗花叶病毒(SCMV))的预防效果,在防虫网室内,采用人工摩擦接种病毒的方法进行生物学试验,并用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对预防效果进行了检测。结果表明,经过TEV保护接种后再接种SCMV的植株长势明显优于只接种SCMV的植株,其叶长、叶宽和株高的差异均达到显著水平(P<0.05);在只接种SCMV全部发病10 d后,有13.8%经保护接种的植株叶片开始轻微褪绿,极大地延迟了花叶症状的发生;攻击接种50 d后,经TEV保护接种后再接种SCMV的玉米植株,体内SCMV CP基因表达量为只接种SCMV玉米的0.113 4倍。说明,SCMV能够有效地减轻玉米矮花叶病的发生及危害。

烟草蚀纹病毒的鉴定和主要特性研究

采用人工摩擦接种和桔斑分离技术，从陕西烟田普遍表现叶脉坏死的自然感病烟草（NC89）叶片上分离到蚀纹病毒源，经鉴别寄主测定，琼脂免疫双扩散试验和病叶超薄切片的电镜观察，初步鉴定出所分离的毒源为烟草蚀纹病毒（TobaccoEtchVirus－TEV）。病毒粒子呈弯曲线状，多为723nm×11．5nm，在细胞质中有风轮状和其它形状的内含体。TEV在烟草病汁液中的3种物化特性为：钝化温度为56℃，稀释限点为10－4，在室温条件下体外存活期为7～9天。将提纯的病毒样品进行有关理化分析试验。结果显示：病毒粒子的沉降系数为S20,w=153S,A260/280=1.15,A=2.56.粒子外壳蛋白为单一多肽，分子量为3.1×104。核酸为单分子RNA，分子量为3．2×104。桃蚜传播所需的最短获毒和传播时间均为10S，最长持毒时间为2h，表明桃蚜可进行非持久性传毒。

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

从山东省感病的烟草上分离获得了一烟草蚀纹病毒(TEV)分离物,命名为 TEV-SD1。根据已报道烟草蚀纹病毒外壳蛋白(coat protein CP)基因序列设计并合成2条引物,通过 RT-PCR 扩增得到长度约800 bp 的目的片段。将目的片段与质粒 pET-22b(+)连接,构建了包含 TEV CP 基因的原核表达载体 pETEV-CP,并导入大肠杆菌 BL21中。序列分析表明:TEV-SD1的 CP 基因全长789bp,编码263个氨基酸;与 GenBank 中已报道的 TEV 5个分离物 CP 基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为94.1％～98.6％。37℃培养条件下,BL21/pETEV-CP 经 IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 结果显示,表达的 TEV CP 融合蛋白的相对分子质量约为33 kDa。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/2048,且具有良好的特异性。

烟草对蚀纹病毒和马铃薯Y病毒的抗病性鉴定

【目的】对21份我国生产中大面积推广使用的烟草品种和抗源材料进行烟草蚀纹病毒(TEV)和马铃薯Y病毒(PVY)的抗病性鉴定,为烟草抗病品种的利用与品种合理布局,以及烟草抗病毒病育种的亲本选择提供依据。【方法】以21份烟草品种为材料,于2009-2011年采用大田人工接种鉴定的方法,对21分烟草种质资源进行了TEV和PVY的抗病性鉴定。【结果】在供试种质中,对TEV表现抗病的有双抗70、云烟97、中烟103、秦烟96、辽烟17、云烟203、秦烟98、云烟85、G28共9份材料,表现中抗的有中烟90、龙江237、NC89、G80共4份材料,表现中感的有云烟87、RG11、净叶黄共3份材料,表现感病的有K326、红花大金元、CV87、Coker176、金星6007共5份材料。对PVY表现抗病的材料有2份,分别为辽烟17和金星6007,表现中抗的材料有秦烟98、秦烟96和双抗70共3份材料,表现中感的有NC89、云烟87、净叶黄、G28、云烟85、红花大金元、G80、K326共8份材料,表现感病的有Co-ker176、龙江237、云烟97、RG11、中烟90、中烟103、CV87、云烟203共8份材料。其中兼抗TEV和PVY 2种病毒病的材料有4份,分别为双抗70、秦烟98、秦烟96和辽烟17;均表现感病的有7份材料,包括Coker176、CV87、红花大金元、K326、净叶黄、RG11和云烟87。TEV和PVY侵染对抗病性较强烟草品种生长发育的影响较小,而对感病品种的影响较大。【结论】不同烟草品种对TEV和PVY的抗病性存在较大差异,抗病性不同的烟草品种在病毒危害以后,病毒对烟叶的产量和叶片生长发育的影响也不同。

烟草蚀纹病毒山东分离物全基因组序列的克隆和保守性分析

为利用RNA介导的病毒抗性策略,培育抗性稳定或抗多烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)株系的转基因植株,采用RT-PCR及5'-RACE方法克隆了烟草蚀纹病毒山东分离物TEV-SD1的全基因组序列。TEV-SD1全基因组核苷酸序列长度为9494 bp,包含1个9165 bp的开放阅读框架(open reading frame,ORF),编码3054个氨基酸。将TEV-SD1基因组序列与GenBank中已公布的4个TEV全基因组序列和11个外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列比对分析发现,各分离物CP基因间的核苷酸和氨基酸序列平均相似性分别为96.65%和98.31%,高于其它功能基因间的相似性;各分离物CP基因3'端核苷酸序列相似性平均为96.55%,高于5'端序列。聚类分析发现TEV在自然界中的分子变异与其寄主关系密切。

钴离子对烟草蚀纹病毒蛋白酶结构的影响

烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco Etch Virus protease,TEVp)是一种高特异性、高保守的重要工程蛋白,其结构稳定性尤为重要;钴离子(Co^(2+))具有一定的生物毒性.为了解Co^(2+)对TEVp结构的影响,运用内源荧光方法和同步荧光方法探讨Co^(2+)对TEVp结构的调控机理.光谱显示Co^(2+)对TEVp内源荧光有明显的淬灭作用,导致TEVp分子中色氨酸和酪氨酸残基的疏水性增加.在300 K和311 K温度条件下,淬灭常数K_(sv)分别为4.161×10~2L/mol和2.129×10~2L/mol,结合平衡常数K_A分别为6.625×10~3L/mol和5.132×10~3L/mol,且动态荧光淬灭速率常数Kq远大于扩散碰撞淬灭速率常数的最大值2.0×10^(10)L mol^(-1)s^(-1),表明其淬灭机制属于静态淬灭.吉布斯自由能ΔG<0,焓值ΔH<0且熵值ΔS>0,表明Co^(2+)与TEVp的相互作用能够自发进行,且它们之间的主要作用力类型为静电作用力.本研究分析Co^(2+)对TEVp多种荧光光谱性质的影响和Co^(2+)对TEVp结构影响的作用机制,可为TEVp在生物学和生物工程等领域的有效利用奠定基础.

辣椒病毒病的防治

1 发病规律 引起甜（辣）椒病毒病的病毒主要有：黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、苜蓿花叶病毒、烟草蚀纹病毒、马铃薯X病毒、蚕豆萎蔫病毒等。传播途径随其毒源种类不同而异，但主要可分为虫传和接触传染两大类。借蚜虫传播的病毒主要有前三种病毒，烟草花叶病毒靠接触及伤口传播，通过整枝打杈等农事操作传染。