烟草转基因内标准定量检测中竞争性模板的制备

以转基因烟草为材料,通过DNA提取、PCR扩增获得NOS终止子片段产物,以重叠延伸扩增法制备该片段的竞争性模板,并进行酶切验证。

利用卡那霉素筛选烟草转基因植株的技术研究

待供试材料转基因和非转基因云烟87烟株长至5～7片叶时，在第3片叶上连续5d喷施400mg／L的卡那霉素溶液，喷后2d观察，结果非转基因云烟87烟株叶片全部产生黄色斑点，而带有卡那霉素抗性标记基因的转基因云烟87烟草叶片表现正常。利用此方法对转基因烟草T2代3个株系进行筛选，筛选出22株转基因烟草植株，并用PCR方法对此方法的准确性进行了验证，结果表明，此方法对转基因烟草是一种简单快速的筛选方法。

烟草转基因研究常用遗传元件筛查策略

通过检索国内外近10年烟草转基因研究的相关文献,建立了转基因烟草常用转化遗传元件的数据库,统计了每个遗传元件及组合元件的使用频率后,发现利用7种遗传元件,包括:启动子P-35S、标记基因NPT II、HPT、Bar和aadA、报告基因GUS及终止子T-NOS作为靶标元件组合,能使目前烟草转基因事件的理论筛查率达到100%,从而构建出转基因烟草的优化筛查策略。

烟草转基因检测技术考察报告

中国烟草基因技术交流代表团收稿日期：１９９８－０９－２３责任编辑：董志坚１９９８年６月７日～２３日，由中国烟草进出口总公司组织，黑龙江省烟草公司、中国烟草东北农业试验站、中国烟草育种研究（南方）中心、郑州烟草研究院组成的烟草转基因技术交流团一行７人，...

异源表达盐单胞属(Halomonas)周质磷酸盐结合蛋白基因PBP降低转基因烟草砷积累研究

为探讨PBP基因在异源烟草中的生物学功能,筛选出低砷(As)积累亲本烟草种质。以转PBP基因烟草T2代种子和野生型烟草(Nicotiana tabacum K326)种子为材料,利用Real-time PCR分析外源PBP的时空表达模式,测定As胁迫下转基因烟株抗氧化酶(AOEs)活性变化及分析转基因烟草株系中As积累差异。AOEs活性测定表明,As胁迫第5天时CK植株中SOD和POD酶活性达到极值,分别为80.25 U/g和152.02 U/g,显著高于转基因植株;在胁迫后期(3~5 d)CK植株中H2O2和MDA含量也显著高于转基因植株。另外,在第7天和14天时转基因植株中As含量比CK植株均显著降低。离子转运蛋白基因表达分析表明,As胁迫不仅诱导转基因植株PBP基因表达显著上调,而且也引起转基因和CK植株中HAK1和PHT4等通道蛋白基因的显著上调,且CK植株中HAK1和PHT4的平均表达水平为转基因植株的1.5倍和3.75倍。外源PBP基因导入可有效降低转基因烟草对As的积累。

大豆GmNCED1-2的非生物胁迫诱导表达及其转基因烟草鉴定

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成途径中的关键酶。本研究从大豆中克隆GmNCED1-2,其开放阅读框全长1818 bp,编码605个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量6.693×104,等电点8.00。GmNCED1-2蛋白含有1个RPE65超家族结构域、2个保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE以及4个保守的组氨酸残基。GmNCED1-2蛋白的亚细胞定位预测结果显示其位于叶绿体中。蛋白质系统进化分析结果表明GmNCED1-2蛋白与CrNCED1蛋白和MhNCED3蛋白的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明GmNCED1-2在叶中的表达量最高。脱落酸、干旱、高盐、高温和低温胁迫下GmNCED1-2的表达量均升高。顺式作用元件预测分析结果表明GmNCED1-2启动子含有2个ABRE,3个ARE,1个TC-rich repeats和1个TGACG-motif顺式作用元件。将GmNCED1-2构建植物表达载体并转化烟草,获得3棵转基因烟草植株。烟草根长和生物量测定结果显示,GmNCED1-2的过表达抑制了转基因烟草根的伸长及植株的生长。

水稻OsMGD2和OsMGD3基因的功能鉴定及其对烟草耐低磷胁迫的影响

【目的】单半乳糖甘油二酯合酶(MGD)是合成单半乳糖甘油二酯(MGDG)的关键酶,在植物响应低磷胁迫过程中起着重要作用。为系统了解水稻OsMGD2和OsMGD3基因在低磷胁迫响应中的作用和功能。【方法】用盆栽试验分析正常和低磷条件下野生型(SR1)、过表达OsMGD2和OsMGD3转基因烟草的生理响应及脂质组分的变化。【结果】无论在正常还是低磷条件下,转基因与野生型烟草的磷含量无显著差异,但转基因烟草的生物量、叶绿素含量和光合能力均显著高于野生型。转基因烟草在低磷胁迫下的磷脂(PL)含量、双半乳糖甘油二酯(DGDG)含量、DGDG与MGDG的比值和半乳糖脂(GL)与PL的比值均显著高于野生型烟草,且OsMGD3转基因烟草的脂质含量和比值均高于OsMGD2转基因烟草。【结论】通过调控水稻OsMGD2/3基因表达,可提高植物低磷下的膜脂重塑能力,进而维持植物在低磷胁迫下较高的光合和生长能力,增加植物的低磷耐受性。

过表达马铃薯StuPPO9基因对烟草抗旱能力的影响

为鉴定马铃薯多酚氧化酶基因StuPPO9在干旱胁迫响应中的功能,本研究以利用农杆菌介导法获得的过表达StuPPO9基因的本氏烟草为材料,通过盆栽试验模拟自然干旱胁迫,对比转基因株系和空载转化(WT)烟草植株干旱胁迫0 d、3 d、6 d、9 d、12 d的生长形态,测定叶绿素、丙二醛、脯氨酸含量和抗氧化酶活性等生理指标以及抗旱相关基因的表达情况。结果表明,干旱处理后过表达株系叶片的相对含水量、叶绿素、脯氨酸含量以及SOD、POD活性均显著高于WT,而丙二醛含量则显著低于WT。RT-qPCR分析发现,活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除系统基因SOD、POX, ABA生物合成基因NCED、RD29A,脯氨酸生物合成基因P5CS以及其他应激反应基因LEA、ADC、SAMDC等的表达量明显升高。本研究表明,StuPPO9基因增强了烟草植株对干旱的耐受性,为探明StuPPO9基因调控干旱胁迫响应的功能提供理论依据。

羊草WRKY40的克隆及其转基因烟草抗病性分析

为了培育抗白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)以及恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)等病菌的水稻品种,通过挖掘抗病基因选育抗病品种。利用RT-PCR方法从羊草(Leymus chinensis)叶片中克隆LcWRKY40基因(登录号:MN187915),其CDS全长1053 bp,编码350个氨基酸,分子质量为38.1 kDa。生物信息学分析结果表明:LcWRKY40一级结构包含WRKY结构域,并且存在锌指蛋白结构域以及核定位序列。系统进化树的构建及基序分析发现LcWRKY40和HvWRKY38亲缘关系接近。烟草(Nicotiana tabacum)亚细胞定位结果表明LcWRKY40蛋白定位于细胞核中,验证了软件预测。经qRT-PCR组织特异性表达分析表明LcWRKY40基因在羊草的根、茎、叶、叶鞘、稃和花药中都有表达,但表达量在叶中最高,稃中最低。利用水稻的白叶枯病菌、纹枯病菌、稻瘟病菌以及恶苗病菌对转基因LcWRKY40烟草植株与野生型烟草植株进行接菌试验,研究结果表明转基因LcWRKY40烟草植株对4种病菌有不同程度的缓解作用,对稻瘟病菌与恶苗病菌的侵害表现出较高抗性。因此推测LcWRKY40蛋白在抵御病害胁迫、提高植物病原菌抵抗力等信号途径中发挥关键调节作用。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究

为了构建高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体,首先对人源抗狂犬病毒抗体(SO57)重链和轻链编码基因的密码子进行偏好性改造,添加增强外源基因表达的控制元件,然后分别与花椰菜花叶病毒35s启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子融合,连接至植物表达载体pBI121上,然后将构建好的载体转入农杆菌LB4404,采用叶盘法转化烟草叶片。用分子生物学技术,对6株转基因烟草进行检测,电泳检测结果均为阳性。用酶联接免疫吸附剂法,检测6株烟草叶片中人源抗狂犬病毒单克隆抗体的表达。结果表明,6株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体。

表达苏云金杆菌δ-内毒素基因的转基因烟草的抗虫性

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)HD-1的δ-内毒素基因原始克隆TH12和TH48分别含有5.3kb和6.6kb型两类同源异族基因。经定点突变改造其5′端,酶切对3′端进行缺失后,在大肠杆菌中仍能表达出有杀虫活性的被修饰的毒蛋白。将上述加工过的基因插入到双元载体pBin437(pBin19的派生质粒)中,借助辅助Ti质粒pAL4404转入烟草,获得了抗卡那霉素的再生植株。经Southern印迹和狭槽印迹(Slot blot)杂交证明有1—5个拷贝的毒素基因整合至烟草染色体中。Northern印迹法分析结果表明这两类基因都在转基因植株中得到表达。有4株5.3kb类型,3株6.6kb类型的转基因植株对烟青虫有高抗性,与对照相比,这7株转基因烟草植株的杀虫率可达40—50%,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现明显的抗虫作用。结果表明这两类毒蛋白基因都可在植物中表达并赋于转基因植株以抗虫性。

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12(Gh12)、中棉36(Gh36)和海岛棉7124(Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签"PKRRAGRKKFQETRHP"和"FADSAW"。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T1代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。

高度耐盐双价转基因烟草的研究

随着全球性人口的增长和土地退化的加剧,开发利用广阔盐碱地和干旱土地的需要日益迫切。植物生物技术的日臻完善,为培育高效耐盐植物迎来了一丝曙光。在高渗条件下,耐盐的微生物或植物细胞通过增加胞内一些相溶性溶质的浓度来维持渗透压的平衡。这些可溶性溶质包括无机离子、糖类、多元醇、氨基酸和生物碱等。通过基因工程手段,使细胞内积累脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、海藻糖,能够不同程度地提高转基因烟草的耐盐性。多元醇含有多个羟基,亲水性能强。

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

以马铃薯 Y病毒坏死株系 (PVYN)的 RNA为模板 ,应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,扩增出长度为 80 1bp的非翻译的马铃薯 Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到 p BSK的Bam HI和 Kpn I之间并进行了序列测定。用 Bam HI和 Kpn I从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒 p ROKII内得到植物表达载体 p PVYCP。通过根癌农杆菌 (LBA4 40 4 )介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和 Southern blot检测 ,获得 82株转基因植株。 Northern blot和Western blot分析表明 ,转基因植株只在 RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异 ,其中有 7株是对 PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明 ,对 PVYN 表现高度抗病的植株对 PVYO 也具有高度抗病性。

表达β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因烟草及其抗真菌病的研究

利用烟草碱性β－１，３－葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价植物 表达载体ｐＢＬＧＣ，利用农杆菌介导法转化了烟草，并得到了转基因植株。对其进行分子生物 学分析的结果表明，部分转基因植株在所有检测中都显示较强的阳性反应，这说明外源基因 已整合到烟草基因组中并得到正确表达。活体接菌实验初步表明，转基因植株与对照相比，对 赤星病的侵染具有较强的抵抗能力。

中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var.jinhua)光诱导基因cab 5′上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5′端缺失体,并将这些缺失体分别与gus(uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,GacabP驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且?504～?1 bp的启动子缺失体启动活性最高。

转基因烟草的甘露醇合成和耐盐性

土壤的盐碱性是世界许多地区限制植物生长和作物产量的主要制约因素。长期的研究发现:在高盐或干旱环境下,大多数植物在细胞质中开始积累一些低分子量的代谢物,如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。这些物质通过维持高的细胞质渗透压,有利于植物在高盐或干旱条件下的水分吸收。通过基因工程手段,影响或改变植物体内的生理代谢途径,使得植物细胞产生和积累不同的低分子量有机化合物。

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因 (aroAM12 )和人工合成重组Bt抗虫基因 (Bts1m)的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制 ,Bts1m基因的表达由 2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导 ,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中 ,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southernblot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因 ,约 70 %的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northernblot、Immunodotblot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达 ,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明 。

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP(stress-associated protein)是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100μg·mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol·L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U·g-1 FW和8.37%,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg·g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg·g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol·g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol·g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。

两种凝集素基因在转基因烟草中表达的研究

构建了含尾穗苋凝集素基因(ACA)的cDNA序列和改造后的雪花莲凝集素基因(GNA)的植物表达载体pBACG。在此表达载体中,ACA和GNA基因的表达分别由35S启动子和CoYMV启动子控制。通过农杆菌介导,将ACA和GNA基因转化到烟草中,经卡那霉素筛选获得60株转化再生植株。对PCR检测呈阳性的50株植株进行接蚜虫实验,结果表明,其平均抑虫率达83.9%。Southernblotting分析表明,ACA和GNA基因都已整合到烟草基因组中。Westernblotting结果显示这两个基因在不同植株中都可表达其相应的蛋白质,但表达水平不同。部分Westernblotting分析呈阳性植株的抗蚜性与T0代相近,达85.3%,说明这两个基因的抗蚜功能可以稳定遗传。