烟草辣椒脉斑驳病毒病的发生与防治技术研究进展

辣椒叶脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)为严重危害茄科植物的一种(+)ssRNA病毒,可侵染辣椒、番茄、茄子、烟草等。该病毒具有较强的致病性和破坏性,侵染烟草后会诱发系统性叶片枯斑坏死,导致烟草叶片自下而上干枯脱落甚至整株死亡。本文总结了烟草辣椒脉斑驳病毒病的传播方式和感染特征,并从农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等方面综述了烟草辣椒脉斑驳病毒病的防治措施研究进展,以期为有效控制烟草辣椒脉斑驳病毒病提供参考。

云南烟草产区辣椒脉斑驳病毒的调查及其遗传多样性分析

明确辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在云南6个州(市)烟草生产区的分布、遗传多样性和群体遗传结构,对病害的防控预警具有重要意义。本研究以2022年采集自云南6个州(市)不同烟草产区的96份疑似感染ChiVMV的烟草样品为试验材料,利用电子显微镜负染色观察和分子生物学方法对病毒进行检测和鉴定,获得21个ChiVMV云南烟草分离物的cp基因序列。利用SDT、MEGA、RDP、DnaSP及Arlequin等生物学软件对21个云南烟草分离物及NCBI上下载的38个来自不同国家、地区及寄主的ChiVMV分离物cp基因序列的系统进化、遗传多样性和群体遗传结构特征进行分析。结果显示,从云南6个州(市)烟草生产区采集的96份烟草样品中,ChiVMV检出率为51.04%;序列比对发现,本研究获得的cp基因与NCBI中38个ChiVMV分离物cp基因的核苷酸一致性在84.1%以上;系统发育分析发现,59个ChiVMV分离物按照地理位置的远近被划分为4个分支,聚类结果具有明显的地理分布特征,而与寄主植物无关;遗传多样性和遗传分化分析表明,4个地理种群的ChiVMV cp基因遗传多样性水平均较高,中国种群与印度、泰国和其他国家种群间发生了很大的遗传分化且差异显著(P<0.05);遗传力分析显示,基因交流、遗传漂变和基因的负选择压力是ChiVMV分离物适应性进化的重要方式。

辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备和应用

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是茄科植物生产上危害最严重的病毒之一,也是口岸检疫的对象。本研究旨在制备特异性强的ChiVMV外壳蛋白的多克隆抗体并用于田间病株的检测。【方法】通过RT-PCR方法扩增ChiVMV贵州烟草分离物外壳蛋白基因的全长(861 bp)和部分片段(396 bp),分别重组至原核表达载体pET28a中,转化Escherichia coli BL21后进行诱导表达,表达产物层析分离和透析纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,最后使用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot等方法检测抗体效价和特异性。【结果】成功制备了ChiVMV外壳蛋白的两种多克隆抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa),抗体效价分别为1∶6400、1∶12800;两种抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa)均能通过Western blot方法检测到抗原;田间病株的间接ELISA检测显示,antiCP^(1-132aa)能特异性检测ChiVMV病株,未能检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病株,而antiCP^(1-287aa)无法区分这两种病株。【结论】多克隆抗体antiCP^(1-132aa)的特异性较强,可用于ChiVMV田间病株的检测,也为ChiVMV外壳蛋白的功能研究奠定基础。

侵染贵州烟草的辣椒脉斑驳病毒鉴定及其基因组分子特征分析

【目的】明确辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在贵州烟草上的发生情况及其与我国其他省份不同ChiVMV株系之间的遗传进化关系,为制定科学合理的防控措施提供依据。【方法】从贵州省贵阳、遵义、安顺和铜仁的烟田采集表现叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶等症状的疑似病毒侵染的烟叶样品80份。采用RT-PCR法,设计多种病毒引物对所采集的样品进行检测,对检测出的ChiVMV进一步进行PCR分段扩增以获得贵州烟草ChiVMV的全基因组序列,基于NCBI已公布的所有ChiVMV基因组序列进行序列一致性分析并构建系统发育进化树,以研究贵州ChiVMV烟草分离株的遗传进化关系。【结果】RT-PCR检测结果显示,ChiVMV在贵州烟区检出率为37.50%,烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)检出率为48.75%,马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的检出率为35.00%,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)检出率仅8.75%;检测出4种复合侵染类型TMV+PVY、PVY+ChiVMV、PVY+CMV和ChiVMV+PVY+TMV,检出率分别为26.25%、6.25%、10.00%和3.75%。PCR分段扩增获得贵州省烟草分离株ChiVMV-GZ(GenBank:OP589298),其与来自四川的番茄分离株(KC711055)和四川烟草分离株(MK405594)具有较高的序列一致性(98.70%和98.50%);构建系统发育进化树发现其与来自四川和云南的ChiVMV株系聚为一支。【结论】辣椒脉斑驳病毒在贵州烟草上的为害已日趋严重,应当引起足够重视,本研究在贵州烟草上分离获得分离株ChiVMV-GZ并扩增获得该病毒全基因组;基于遗传进化分析发现,ChiVMV-GZ与来自四川和云南的ChiVMV株系间的亲缘关系最近。

烟草扭脉病毒云南分离物rtp基因克隆及序列分析

探究来自云南不同时间和不同地区的烟草扭脉病毒(TVDV)各分离物间rtp基因序列差异,分析烟草丛顶病近年在田间发生趋势减缓的原因.以2020—2022年从云南楚雄、大理、保山及红河采集的染病烟草样品为材料,对TVDV的rtp基因进行扩增和序列分析,共得到TVDV 7个不同分离物的rtp基因序列,长度均为2172 nt,包含618 nt的cp基因及1554 nt的rtd区;推导的TVDVRTP蛋白共编码722个氨基酸,其中包含CP蛋白的205个氨基酸,RTD的517个氨基酸.多重序列比对结果发现,获得的7个TVDV分离物与GenBank上登录的其他TVDV分离物间cp基因核苷酸序列一致性为98.71%~100%,不同TVDV分离物间CP蛋白的氨基酸序列一致性为98.05%~100%,存在4个氨基酸的差异.获得的7个TVDV分离物与GenBank数据库登录的其他TVDV分离物间rtd区核苷酸序列一致性为96.68%~99.81%,RTD蛋白的氨基酸序列一致性为96.52%~100%,存在39个氨基酸的差异.这些TVDV分离物rtp基因的变异可能会对TVDV的蚜虫传播效率产生影响,进而影响到烟草丛顶病在田间的发生与流行.

烟草脉斑驳病毒侵染本氏烟的转录组研究

为了研究烟草脉斑驳病毒(TVMV)侵染本氏烟的抗病分子机制,本文建立了TVMV转录组数据库,挖掘抗病相关基因以及代谢和信号通路,采用Illumina Novaseq 6000高通量测序平台对侵染TVMV的本氏烟进行转录组测序,并进行生物信息学分析;利用R package:edge R等软件分析了有关抗病的差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)基于途径的通路富集分析。基于TVMV侵染本氏烟转录组的测序结果中共获得4593个差异表达基因,其中3564个基因上调表达,1029个基因下调表达。共筛选出10个抗病相关的差异表达显著基因,6个上调,4个下调。GO数据库中注释到生物学过程、细胞组分及分子功能等三大类共50个功能组。其中,在第三大类分子功能中,蛋白质结合功能以及ATP结合功能所涉及的差异表达基因最显著,分别为501个和453个差异基因。KEGG共富集20条通路,注释到核糖体途径的差异基因富集程度最高,基因最显著,差异表达基因数为307个。蛋白质结合、ATP结合、核糖体、真核生物核糖体的生物反应、DNA复制(DNA replication)等通路可能在调控本氏烟抗TVMV病毒中起着重要作用。通过对转录组中筛选的差异表达基因进行分析研究,为后续本氏烟抗TVMV病毒的深入研究奠定了重要的基础。

烟草品种辣椒叶脉斑驳病毒病的症状与抗病性鉴定

辣椒叶脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)为马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种,在我国烟草上的危害呈上升趋势,了解ChiVMV侵染烟草品种的症状和品种的抗性有利于病害防治。本文通过塑料大棚内摩擦接种,分析了21个烟草品种的症状特征和对ChiVMV的抗性。ChiVMV侵染烟草的典型症状为褪绿黄化、花叶、疱斑和叶缘下卷。按照国家标准GB/T 23224—2008,依据接种ChiVMV后14 d的平均病情指数,各品种对ChiVMV的抗性分别为:MD609,巴斯玛1号和云烟97为感病,MSK326,MS云烟87,MS云烟85,红花大金元等18个供试品种为高感。云南省烟草主栽品种缺乏对ChiVMV的抗性,ChiVMV的危害需要引起重视。

南美红辣椒脉斑驳病毒RT-LAMP检测体系的建立及优化

南美红辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是一种严重危害茄科作物的正单链RNA病毒,也是云南烟草上的主要病毒之一。本研究采用单一变量法,建立并优化检测ChiVMV的反转录环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)体系。对RT-LAMP的反应时间、反应温度及体系中Mg 2+、dNTPs、甜菜碱浓度和内外引物浓度比进行优化,同时用RT-PCR对优化后的RT-LAMP检测体系进行灵敏度验证。结果表明,最佳引物组为CH-CP-3,在25μL反应体系中各组分最佳加入量为:缓冲液2.5μL,MgSO 4(100 mmol/L)0.5μL,dNTPs(10 mmol/L)0.5μL,FIP/BIP(10 mmol/L)2μL,F3/B3(10 mmol/L)0.5μL,LF/LB(10 mmol/L)1.5μL,甜菜碱(5 mmol/L)5μL,Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase(8000 U/mL)0.5μL,M-MLV酶(10000 U/mL)0.125μL,RNA(≥50.7 fg)1μL,DEPC H 2O补至25μL;最佳反应温度及时间为63℃50 min,优化后的RT-LAMP检测结果与RT-PCR检测结果一致,且其灵敏度是RT-PCR的100倍。本研究建立的ChiVMV RT-LAMP检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点,为开发ChiVMV RT-LAMP检测试剂盒及其实际应用提供了重要基础。

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物(ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC)的基因组。分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9717个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号:GQ981316)。在核苷酸序列的第164位～第9270位存在一个大的开放阅读框(ORF),编码一个多聚蛋白(分子量为350.44kD)。近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF(pretty interesting potyviridae ORF,PIPO)存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2892位～第3110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽(分子量为8.26kD)。ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率。本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位。

湖南和福建辣椒上辣椒脉斑驳病毒的检测及系统发育分析

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV),目前在我国仅有在海南黄灯笼辣椒上严重危害的报道。利用湖南省和福建省采集的辣椒样本,检测辣椒ChiVMV的检出率,并克隆ChiVMV的CP基因序列,用邻近法构建了系统进化树,分析其遗传进化情况。结果表明,辣椒的ChiVMV省检出率湖南省为25%,福建省为20%;克隆了湖南省和福建省ChiVMV CP基因各1个,系统发育表明,湖南省和福建的ChiVMV株系与源于韩国ChiVMV株系聚在一个亚簇,而与我国其他地区ChiVMV亲缘关系较远,表明侵染辣椒的ChiVMV在我国进一步扩展,且存在遗传分化趋势。

湖北和广西辣椒脉斑驳病毒的检测及遗传多样性分析

【目的】研究辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)的分布及遗传变异,为明确该病毒在我国的流行扩散分子机制提供理论依据。【方法】利用特异性引物反转录PCR(RT-PCR)检测从湖北宜昌及广西南宁和百色采集的48份疑似感染PVMV的辣椒样本;采用常规Sanger测序测定PCR产物序列,序列采用MEGA 5.0构建系统发育进化树,采用RDP等算法分析其可能的重组事件;采用DnaSP v5分析病毒株系不同群体之间的基因流及基因差异。【结果】从48份辣椒样本中检测到5份样本被PVMV侵染,检出率10.42%。基因同源性比对分析结果表明,测定的PVMV湖北和广西分离物CP基因序列同源性在97.00%以上,与其他地区分离物的同源性为91.73%~98.78%。系统发育分析表明,湖北(YC)和广西(NN)PVMV分离物与我国台湾PVMV分离物的亲缘关系最近。重组分析表明,PVMV广西分离物NN10有2个重组事件。【结论】湖北和广西辣椒的PVMV检测结果表明,该病毒已扩散至湖北和广西;基因突变可能是PVMV湖北分离物遗传变异的主要方式之一;而基因重组和基因突变可能是PVMV广西分离物遗传变异的重要因子。

辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白(coat protein,CP)和圆柱状内含体蛋白(cytoplasmic inclusion protein,CI)保守区域分别设计引物,筛选两个基因(CP和CI)的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2μL、CP337-F/CP337-R各0.625μL(10μmol·L-1)、CI655-F/CI655-R各1.375μL(10μmol·L-1)、2×PCR Master Mix12.5μL、ddH2O 6.5μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。

辣椒脉斑驳病毒湖南分离物全基因组序列测定及分子特征

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是东南亚茄科作物主产地主要病毒种类之一,严重危害辣椒等茄科作物的生产。测定ChiVMV的全基因组序列,分析其分子特征,可以明确该病毒的适应性进化以及对我国辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学基础。【方法】以湖南疑似感染ChiVMV辣椒为样本,采用small RNA高通量测序结合RT-PCR测定病毒全基因组序列,利用Mega、RDP及DnaSP等生物学软件分析其分子特征。【结果】ChiVMV湖南分离物全长基因组序列为9704 nt(不包含3′-A尾),与其他分离物的序列同源性为84%~94%。系统发育分析表明,我国的ChiVMV聚类为一个亚簇,与其他国家和地区分离物不存在重组事件。基因的替换指数R=3.29,替换碱基类型主要是C/T替换。【结论】碱基替换突变可能是ChiVMV湖南分离物适应性进化的主要因素。

贵州辣椒脉斑驳病毒的检测及株系分化研究

【目的】明确贵州辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,Chi VMV)的分布和遗传进化情况,为该病毒的基因功能及其与宿主植物互作关系研究提供科学依据。【方法】采用反转录PCR(RT-PCR)对采自贵州贵阳、遵义、黔西和大方的疑似Chi VMV辣椒样品进行扩增并测序;运用DNAMAN和MEGA对Chi VMV CP基因和和3'-UTR进行序列拼接及分析,并构建系统发育进化树。【结果】从39份疑似Chi VMV辣椒样品中检测出7份阳性样品,检出率为17.95%。将贵州Chi VMV株系的部分CP基因和3'-UTR序列在NCBI中进行核苷酸序列比对,发现其与来源于四川辣椒上的Chi VMV株系的同源性最高,为99%,与我国其他省份Chi VMV株系同源性大于90%;构建的系统发育进化树表明贵州株系与四川和云南株系亲缘关系最近。【结论】贵州Chi VMV株系存在明显的株系分化现象。

种传辣椒轻斑驳病毒病DAS-ELISA的检测

2003～2004年在北京、宁夏等地分批次从田间采集标样,利用辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)抗体,采用双抗体夹心酶联免疫吸附反应(DAS-ELISA)对采集的标样进行检测,结果表明北京地区被检测的24个标样中,有19个样品为阳性,占79.17%,宁夏的23个样品中检出2个样品为阳性,占8.5%.

甜椒L3应对辣椒轻斑驳病毒及中椒系列新品种的选育

辣(甜)椒是我国栽培面积最大的蔬菜作物,年播种面积约2.2×106 hm2,其中甜椒约5×105 hm2。生产上传统病害如疫病、病毒病等依然严峻,近年来辣椒轻斑驳病毒(PMMoV,烟草花叶病毒属)等新型流行病害爆发,严重制约甜椒生产;同时,消费者对品种的品质、多样性提出更高要求。笔者课题组先后从国内外引进甜(辣)椒种质资源1400余份,通过鉴定、评价,筛选出具有抗病毒病、白粉病和果大、皮薄、光泽度好、品质优等优良性状的种质资源120余份。构建了与抗TMV(L3、L4)、抗番茄斑点萎蔫病毒TSWV(Tsw)等重要性状紧密连锁的分子标记,辅助育种准确率达90%以上。通过常规育种技术和分子标记相结合,创制出含有抗PMMoV(P0,1,2)L3,且兼具抗TMV、ToMV、PMMoV(P0,1,2)、CMV和疫病,果大、果实均一度高、光泽度好等综合性状优良、配合力高的甜椒骨干亲本‘0516’,以其为骨干亲本,培育出4个新一代优质、多抗、适应不同生态区的新品种‘中椒105号’‘中椒106号’‘中椒107号’‘中椒108号’。上述系列新品种含有L3,抗TMV、PMMoV(P0,1,2),兼抗CMV和疫病;果实形状大小、色泽、整齐度等商品品质,Vc等营养品质显著提高。

烟草脉扭病毒基因组部分序列的克隆和分析

烟草脉扭病毒(Tobacco vein distorting virus, TVDV)是引起烟草丛顶病的两种病毒之一。TVDV被归为黄症病毒科的暂定成员。应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物,通过RT—PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因组的部分序列。序列分析获得了长度为1654 bp的序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列、外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列。根据这三个基因编码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员。根据其基因间隔区的长度特征和各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员。这是TVDV的分子生物学特征的首次报道。

从烟草丛顶病病原复合物中分离烟草扭脉病毒的方法

烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒（TBTV）、烟草丛顶病毒类似卫星RNA（Sat-TBTV）、烟草扭脉病毒（TVDV）和烟草扭脉病毒相关RNA（TVDVaRNA）复合侵染引起的一类特殊病害,目前尚不清楚这些病原物各自在病害症状形成和病害传播中的作用。本文根据蚜虫传播烟草丛顶病复合病原物传毒特性的差异,探索了3种分离TVDV的生物学方法。方法A为将获得了烟草丛顶病复合病原物的蚜虫饥饿24h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法B为将无毒蚜虫饥饿2-4h后转接到感病烟株上饲毒48h,再以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法C为将无毒蚜虫于感病烟株上饲毒48h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒24h,此后每隔24h将蚜虫移到另一健康烟株上传毒,直到蚜虫死亡。其中方法 A和B均可将TVDV从烟草丛顶病病原复合体中分开,方法A操作简单、分离周期短且TVDV的分离效率高。单独TVDV侵染的烟株无明显的丛顶症状,叶片靠近主脉的地方会出现皱缩,生长后期叶片变得细长且顶端会发生扭曲。本试验可为研究TVDV与其他病原物、寄主植物和传播介体的相互作用提供很好的试验材料,也可为蚜虫传播的复合侵染病毒的生物学分离提供参考。

香石竹脉斑驳病毒的研究——Ⅰ.病毒的生物学、病理学变化及血清学

香石竹脉斑驳病毒的寄主范围比较狭窄,只能侵染石竹科、藜科、苋科等几个科中的少数几种植物。昆诺藜和美国石竹是该病毒理想的鉴别寄主和繁殖寄主。病毒粒体为微弯曲的线条状,长790nm,宽12nm,能为国外提供的香石竹脉斑驳病毒抗血清均一包被。该病毒能被桃蚜以非持久性的方式传播,传播效率可达58%。本文还对病组织的超薄切片、病毒侵染组织中的双链RNA、病毒的体外抗性进行了研究。