矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPTII和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达载体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达载体。

白三叶CHS基因的过表达提高烟草类黄酮的含量

为探索白三叶(Trifolium repens)查尔酮合成酶基因对类黄酮含量的影响,根据NCBI上提供的TrCHS基因(Genbank:2247906)序列,采用RT-PCR方法克隆获得白三叶查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因全长cDNA片段,命名为TrCHS;成功构建含有TrCHS的植物表达载体,在烟草(Nicotiana)中进行遗传转化,经抗性筛选与分子检测,获得了转基因烟草株系,并对其类黄酮含量进行了测定。结果表明,与野生型相比,转基因烟草植株TrCHS表达量和类黄酮含量均显著提高(P<0.05),表明过表达TrCHS可提高烟草类黄酮的含量,这为后续解析TrCHS功能以及白三叶新品种选育提供了可靠的理论依据。

转基因烟草表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽Ⅱ的研究

研究将东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)抗神经兴奋肽Ⅱ(ANEPⅡ)基因序列定向克隆到植物表达载体pBI121中,构建了植物表达载体pBI-ANEPⅡ。采用三亲交配法和液氮冻融法将重组质粒pBI-ANEPⅡ导入农杆菌中,获得了工程菌pBI-ANEPⅡ/LBA4404。通过农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草叶片外植体,在含卡那霉素的培养基上进行转化体的筛选,获得了转基因烟草。通过PCR检测、RT-PCR和Western blotting鉴定,检测结果表明ANEPⅡ蛋白在转基因烟草植株中得到表达。

Optimization of Genetic Transformation System of Tobacco K326 Mediated by Agrobacterium

[Objective]The aim was to optimize genetic transformation system in tobacco K326 mediated by Agrobacterium.[Method]The leaf of tobacco aseptic seedling was taken as explants to study the optimization of Agrobacterium-mediated genetic transformation system.[Result] The highest transformation efficiency was obtained when the explants were pre-cultured in the medium of MS ＋ 2 mg/L 6-BA ＋ 0.2 mg/L IAA for 2 d,and then infected with Agrobacterium GV3101（OD600 =0.6） for 5 min.The PCR detection proved that npt II gene had been integrated into the regenerated tobacco plants.[Conclusion]A highly efficient genetic transformation system of tobacco leaf mediated by Agrobacterium was established.

‘贵紫麦1号’GzA BI5-3A3基因的克隆及在烟草中的功能分析

ABI5在植物种子休眠与萌发、生长发育、花青素合成以及对逆境胁迫的响应等诸多生物学过程中起着重要作用。而大量研究表明ABI5参与种子休眠与萌发,少有研究表明ABI5参与花青素合成。为了探究ABI5转录因子参与调控小麦花青素合成,本研究从‘贵紫麦1号’中扩增得到Gz ABI5-3A3的c DNA全长。其启动子顺式元件分析结果表明Gz ABI5-3A3可能参与调控植物生长、光合作用、开花及种子萌发和花青素累积的生物学过程。蛋白质系统进化树分析表明,Gz ABI5-3A3与小麦中Ta ABI5D-SH-31、Ta ABI5D-SH-23和Ta ABI5D-SW-23同源。本研究进一步构建Gz ABI5-3A3基因的过表达载体PBI121-Gz ABI5-3A3,用于烟草遗传转化,共获得8个烟草转基因株系。本研究对Gz ABI5-3A3过表达转基因株系进行研究发现,转基因烟草株系L4、L7和L15苗期叶片中花青素含量显著低于野生型,其花青素合成途径的结构基因Nt PAL、Nt DFR、Nt ANS和Nt CHS的表达量显著下降。研究结果表明Gz ABI5-3A3能够通过调控花青素合成途径结构基因的表达来负向调控植物花青素的合成,为后续研究Gz ABI5-3A3调控花青素合成的分子机制提供研究基础。

紫苏bZIP转录因子全基因组鉴定及对非生物胁迫的响应分析

碱性亮氨酸拉链(bZIP)是一类普遍存在于真核生物的转录因子,广泛参与植物生长发育与逆境胁迫响应等生命过程。为解析紫苏(Perilla frutescens)bZIP(PfbZIP)蛋白的生物学功能,本研究应用组学工具全基因组鉴定PfbZIP家族成员及其理化特征,定量PCR检测PfbZIP基因响应非生物胁迫的表达谱,克隆PfbZIP90编码序列,并进行烟草(Nicotiana tabacum)遗传转化。结果表明,紫苏基因组共鉴定到101个PfbZIP家族成员,不均匀分布于18条染色体。PfbZIP蛋白序列长度在112~1269 aa之间,等电点(pI)为4.84~10.88。主要由二级结构单元α-螺旋和无规则卷曲维持PfbZIP蛋白自身结构。亚细胞定位预测PfbZIP定位于细胞核。片段重复是PfbZIP基因家族进化和扩增的主要驱动力。不同PfbZIP成员之间外显子和内含子数目及分布差异较大。PfbZIP蛋白具有高度保守的碱性区域和亮氨酸拉链结构区域。系统进化分析将PfbZIP家族成员划分为10个亚群。PfbZIP基因启动子区包含大量非生物胁迫响应的顺式元件。表达谱分析显示部分PfbZIP基因表达水平在低温和干旱胁迫的紫苏幼苗以及对照植株中差异显著,其中PfbZIP90在低温和干旱胁迫下均显著上调。与非转基因对照相比,异源超表达PfbZIP90的转基因烟草株系可溶性糖含量升高,电导率和丙二醛含量则显著降低,Nt FAD3基因表达和α-亚麻酸(ALA)含量亦显著增加。这表明PfbZIP90能有效介导紫苏和烟草低温和干旱胁迫应答以及脂肪酸合成调控。这些发现为全面探究PfbZIP家族成员的生物学功能,特别是介导非生物胁迫响应的分子调控机制和油脂品质改良提供了新的科学基础。