烟草青枯病菌拮抗细菌GJ-8鉴定、培养条件优化及其防效测定

为获得对烟草青枯病菌有拮抗作用的生防菌,从广西贺州市烟草青枯病发病较重烟田的健康烟株根际土壤中分离获得1株对烟草青枯病菌有较强抑菌活性的菌株,命名为GJ-8。根据形态学、生理生化特征和分子生物学初步将拮抗细菌GJ-8鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。随后采用单因素试验及响应面试验优化菌株GJ-8发酵培养基组分,结果表明贝莱斯芽孢杆菌GJ-8最优发酵培养基组分为玉米淀粉17 g·L^(-1)、黄豆粉10 g·L^(-1)、磷酸二氢钾8 g·L^(-1),优化后抑菌圈直径比优化前提高21.90%,菌体浓度提高3.29倍。GJ-8菌剂施于烟田,对烟草青枯病的防效为23.53%,烟株根际土壤中烟草青枯病菌含量为2.24μg·g^(-1),比对照组菌量减少92.48%,说明施用该菌剂可有效降低烟草青枯病发展。综上,这一研究可为贝莱斯芽孢杆菌GJ-8生防菌剂的开发及应用提供理论基础。

烟草根系提取物及碳水化合物对拮抗菌GZYCT-4根际定殖及青枯病菌抑菌活性的影响

在前期获得1株对青枯病菌有拮抗效果的贝莱斯芽胞杆菌GZYCT-4的基础上,通过细菌趋化性、生物膜形成及其粗脂肽抑菌活性等试验,分析抗、感病烟草根系提取物和烟草根系分泌物中的碳水化合物对活性菌株GZYCT-4根际定殖能力及抑菌活性的影响。结果表明:GZYCT-4对烟草K326根系提取物有明显的趋化反应;烟草K326根系提取物及乳糖可促进GZYCT-4生物膜的形成,其中,添加乳糖后GZYCT-4生物膜形成基因epsD、yqxM和kinC的相对表达量分别是对照组的1.64、1.28、2.06倍。此外,蔗糖及木聚糖的添加可提高GZYCT-4脂肽粗提物对烟草青枯病菌的抑菌活性,诱导bmyB、ituC、fenD等脂肽合成基因的表达,其中蔗糖处理的GZYCT-4中bmyB、ituC、fenD相对表达量分别是对照的24.83、6.67、4.76倍。综上,这一研究为进一步阐明拮抗菌株GZYCT-4在烟草植株中的定殖特征及其生防机制提供了一定的理论基础。

2个烟草青枯病菌菌株的致病力差异与基因组比较分析

【目的】探索比较2个不同青枯病菌菌株之间致病力差异和基因组差异,分析影响菌株致病力差异的关键基因,为烟草青枯病的防治提供理论参考。【方法】从烟草青枯病发病烟株上分离获得不同的青枯病菌菌株并进行鉴定,通过侵染试验比较2个菌株之间的致病力差异,并对2个菌株的基因组进行测序,比较二者之间基因组序列差异,分析影响菌株致病力差异的基因。【结果】从江西省抚州市广昌县和南丰县分离到2株青枯病菌菌株RsTP2和RsTY2,egl测序表明菌株RsTP2和RsTY2均属于亚洲分支演化型Ⅰ中的序列变种13,其中菌株RsTP2对云烟87致病力较强,而菌株RsTY2致病力较弱。通过对2个菌株进行基因组测序,获得二者的基因组框架图,其基因组大小分别为5.43MB和5.23MB。将获得的基因和蛋白序列与相关数据库进行比对,获得基因的功能及物种注释信息。通过分析发现,菌株RsTY2有52个蛋白和菌株RsTP2的44个蛋白比对后序列存在差异,其相似度在50.00%~99.88%,其中存在较大差异的编码蛋白主要是凝集素类蛋白,其次是细胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白。【结论】通过比较不同致病力青枯病菌株RsTP2和RsTY2的基因组序列差异,发现二者基因组中编码凝集素类蛋白、细胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白等蛋白序列差异较大,这类编码蛋白主要参与细菌的黏附、膜溶解、穿透等功能,与细菌侵入宿主细胞的能力关系密切。这几类编码蛋白的差异推测是导致菌株RsTP2和RsTY2致病力差异的重要因素之一。

四种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力比较

为筛选对烟草青枯病菌更具抑菌作用的杀菌剂,采用"改良抑菌圈法"测定了4种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力。结果表明:4种杀菌剂抑菌率随浓度提高,青枯灵、农用硫酸链霉素和克菌康在1450.0、310.0和700.0 mg·L-1浓度下,72 h时抑菌率分别达到94.3%、89.1%和84.4%,辛菌胺醋酸盐的抑菌率在48 h时达到最高78.1%。4种药剂对烟草青枯病菌的毒力大小依次为农用硫酸链霉素>辛菌胺醋酸盐>青枯灵>克菌康,前两者EC50分别为274.57 mg·L-1和148.25 mg·L-1。表明辛菌胺醋酸盐和农用硫酸链霉素是防控烟草青枯病较为理想的杀菌剂。

广东烟草青枯病菌菌系研究

广东主要烟区南雄县和梅州市的烟草青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）没有本质上的差异。供试的菌株对烟草、茄子、番茄、辣椒都有强致病力，均为小种１，对２个花生品种（汕油７１，蔓生型）的致病力均分化为３个类型。所有菌株都能利用３糖３醇产酸，为生化型Ⅲ。琼脂双扩散试验结果表明，绝大部分菌株都能与南雄菌株和大埔菌株的抗血清形成３条吻合相连的沉淀带，说明这两个烟草青枯病菌菌株的亲缘关系十分密切。

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。

豫南烟区烟草青枯病菌拮抗内生细菌的筛选及其防病效果初探

为了获得烟草青枯病菌的稳定拮抗内生细菌菌株,从豫南烟区烟草栽培品种中烟100和云烟87的根茎中共分离到208株细菌,利用平板共培养法筛选出9株对烟草青枯病菌具有拮抗效果的菌株。其中菌株Rsa3对烟草青枯病菌的抑菌效果最好,抑菌圈半径达7 mm,且在转移5~6代后仍具有较强的抑制效果。依据16S r DNA序列,将拮抗菌Rsa3鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。该细菌发酵液对烟草青枯病菌有明显的抑制作用,其作用主要在于菌体本身,在温室盆栽试验中发酵液的防病效果可达79.17%,同时具有促进烟苗根系生长的能力。以上结果表明,拮抗菌Rsa3对烟草青枯病具有较好的抑菌和防病作用,同时对烟苗的根系有明显的促生长效果,具有潜在的应用价值。

不同品种(系)烟草叶片对注射接种烟草青枯病菌的反应

烟草细菌性青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)注射接种烟草叶片,不同烟草品种对青枯菌不同菌株及对同一菌株不同浓度的接种反应具有明显差异。单育3号、金星6007和永定一号经注射接种后症状较重,而005-1和K326的症状较轻。接种不同浓度的青枯菌,烟草叶片的症状发展规律相似,但随接种浓度的增高,症状加重。相同条件下,离体叶片症状表现较重。菌株4-11引起的症状最重,其次为菌株1-1,菌株3-5引起的症状最轻。

崂山常见中药材提取物对烟草青枯病菌的抑制作用

以烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum为病原指示菌,从艾叶Artemisiae argyi等40种崂山常见中药材95%乙醇提取液中筛选对其具有明显抑制作用的活性物质。结果表明,32种(80%)药材提取物显示出不同程度的抑菌作用,其中公丁香Syzygium aromaticum提取物抑菌活性最强,其抑菌圈直径达19.53 mm。采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法分析鉴定了公丁香提取物中12种化学组分,其中相对含量最高的丁香酚(40.43%)抑菌活性最强,抑菌圈直径达18.50 mm,处理6 h对病菌的抑制中质量浓度(EC50)值为0.0292 mg/m L。本研究表明崂山地区抑菌植物具有丰富的多样性,公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治烟草青枯病的良好应用潜力。

豫南烟区烟草青枯病菌的致病力及遗传多样性分析

为有效防控豫南烟区烟草青枯病,对来自信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县的烟草青枯病菌的致病力和遗传多样性进行了测定分析。人工接种试验表明,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力分为强、中和弱3种,不同寄主来源的烟草青枯病菌具有显著的致病力差异。从100个随机引物中筛选出8个扩增条带清晰且具有丰富多态性的引物用于不同地区烟草青枯病菌菌株DNA的RAPD分析,共扩增出720条带,其中多态性带占88.9%。聚类结果和遗传相似系数分析显示,供试菌株可分为A、B两大类,遗传相似系数范围为0.49~1.00,且供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。综上所述,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力存在明显差异且其DNA具有丰富的遗传多样性。

烟草青枯病菌有效药剂的筛选

采用纸碟片法测定了13种药剂对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抑制效果。结果表明,3%四霉素水剂、72%硫酸链霉素可溶性粉剂、80%乙蒜素乳油、80%福美双水分散粒剂、3%中生菌素可湿性粉剂和75%百菌清·腈菌唑可湿性粉剂6种药剂能有效抑制烟草青枯病菌的生长,其中3%四霉素水剂抑菌效果最好,抑菌圈直径为19.10 mm;6种药剂抑菌圈直径随浓度增加而增大;复配药剂中,3%四霉素水剂+72%硫酸链霉素可溶性粉剂、3%四霉素水剂+3%中生菌素可湿性粉剂、3%四霉素水剂+80%福美双水分散粒剂按1∶1混合抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为19.20、18.33、17.73 mm,均优于单一药剂效果。

烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)变异特性的研究

本文研究了25个烟草青枯菌株脱毒后对碳水化合物利用能力和产细菌素能力的变异性。结果表明:脱毒后烟草青枯菌株对糖、醇的利用能力和产细菌素的能力发生了变异。脱毒后不同生物型和反应型菌株的相对比率与脱毒前显著不同。脱毒前生物型Ⅲ的菌株占62.5%,反应型 b 的菌株占12.5%,而脱毒后生物型Ⅲ和反应型 b 的菌株分别为54.1%和25%。生物型Ⅳ和反应型 a、c 的菌株,脱(?)后全部突变力其他的生物型或反应型的菌株。脱毒后还产生了生物型Ⅰ和其他类型的菌株。不同品种和地区菌株脱毒后的变异率不同,变异率景高的为 C_(316)菌株,最低的为 T_(208)菌株和玉溪菌株。脱毒后菌株的平均拮抗范围和对细菌素的平均敏感范围比脱毒前分别降低9%和35%。有一个菌株完全丧失了产生细前素的能力,35%的菌株完全丧失了对细菌素的敏感性。菌栋对不同品种和地区菌株的拮抗范围的变异率与其品种和地区来源密切相关。

烟草青枯病菌生防菌的筛选和鉴定

采用纸碟片法筛选到4株对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有抑菌作用的生防菌C2c、C1a、Tsb和Ch1b,抑菌圈直径分别为51.50、25.95、24.40 mm和20.05 mm。通过16S r DNA序列分析,C2c、C1a和Tsb为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),Ch1b为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。这4株生防菌对烟草赤星病菌(Alternaria alternate)、烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苹果霉心病菌(Trichothecium roseum)等病原真菌也有较好的抑制作用。

竹醋液复合洋葱、鱼腥草提取物对烟草青枯病菌的室内抑制效果

通过室内抑菌试验,研究了竹醋液复合洋葱、鱼腥草提取物对烟草青枯病菌的抑制作用,并进一步揭示竹醋液的增效原理。结果表明:竹醋液复合洋葱、鱼腥草提取物对青枯菌具有显著抑制效果,均达到99%以上;同时竹醋液复合洋葱、鱼腥草提取物络合可能生成新物质,起到增效作用,其中洋葱提取物的增效比较明显。因此,竹醋液复合洋葱提取物可以作为一种新型绿色药剂,对烟草青枯病菌具有一定防效。

烟草青枯病菌对不同氮源利用研究

采用酪朊水解物培养基法研究了安徽宣州黄渡烟草青枯病原菌株对硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硫酸铵、氯化铵和尿素等6种氮源的利用。结果表明:烟草青枯病菌对酰胺态氮尿素利用最好,且与氨态氮和硝态氮利用差异显著;但病菌对铵态氮和硝态氮利用差异不显著。这为烟草青枯病田间防治和合理科学施肥提供理论依据。

烟草青枯病菌分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定

从江西省峡江县烟区采集呈典型症状的青枯病烟株,采用平板梯度稀释分离法分离获得一株病原菌分离株,命名为RSXJ-1。在完成致病性测定的基础上,通过分子生物学方法将该菌株鉴定为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。本文研究了该菌株在不同培养基上的培养性状,结果表明该菌株的培养性状与R.solanacearum的培养性状相一致;对该菌株进一步进行生物型研究,结果显示该菌株能利用乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇和山梨醇氧化产酸并能还原硝酸盐;而不能利用甜醇氧化产酸,据此将该菌株鉴定为生物型Ⅲ-1。

1株抗烟草青枯病菌拮抗菌的筛选及鉴定

在黔南烟区烟草青枯病严重发病的田块采集健康烟草根际土壤进行分离、纯化和培养后共获得35株细菌,通过抑菌圈法筛选出2株对烟草青枯病菌具有良好拮抗效果的菌株S3-1和S3-2,抑菌圈直径分别为1.3cm和1.4cm,抗青枯病的模式菌FZB抑菌圈为1.3cm;通过对目标菌株S3-2开展16S rDNA序列测定,并对测序结果开展BLAST比对,初步鉴定出S3-2菌株属于芽孢杆菌属。

大蒜粗提物对烟草青枯病菌的室内抑制作用测定

在实验室测定了大蒜乙醇和水提取物对烟草青枯病菌的抑菌效果。结果表明:大蒜提取物均对烟草青枯病菌有明显的抑制作用,且随大蒜提取物浓度的增大而增强;大蒜乙醇提取物对烟草青枯菌的抑制作用优于大蒜水提取物。0.2、0.3和0.4 g/mL浓度的大蒜乙醇提取物对烟草青枯病菌的抑制率分别为65.56%、69.26%、75.93%;0.3和0.4 g/mL浓度的大蒜水提取物的抑制率分别为61.85%和72.59%;大蒜水与乙醇提取物的有效抑制中浓度分别为0.14和0.08 g/mL。因此,可尝试以大蒜为原料研制植物保护剂来防治烟草青枯病。

湖南烟草青枯病菌生理小种测定

对来自湖南各烟区烟草青枯病43个分离菌株选择了10个致病性强的病株,接种到烟草青枯病菌生理小种鉴别寄主上,都能侵染烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生,表明所测菌株属于1号生理小种,其中致病力强的菌株为Ps714,Ps711,Ps707,Ps729,Ps735.分别分布在桂阳、蓝山、宁远、桑植、芷江等地.

麻楝果实化学成分及其抗烟草青枯病菌活性的研究

为研究麻楝(Chukrasia tabularis)的化学成分,采用色谱法从麻楝果实乙醇提取物中分离得到15个化合物,利用波谱学方法鉴定其结构分别为:没食子酸甲酯(1)、没食子酸乙酯(2)、没食子酸(3)、ozoroalide(4)、stigmast-4-en-6β-ol-3-one(5)、黄柏呈(6)、chukranin A(7)、chisopanin M(8)、21α,24α-methylmelianodiol(9)、toonaciliatin K(10)、21α,25-dimethylmelianodiol(11)、odoratone(12)、bourjotinolone A(13)、hispidone(14)和phragmalin di-isobutyrate(15)。化合物4~14为首次从麻楝属植物中分离得到。采用滤纸片琼脂扩散法对单体化合物进行抗烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的活性研究,结果表明化合物1、2和3具有中等拮抗活性。