烟草黄酮醇合酶基因(NtFLS)的生物信息学及表达模式分析

为探究烟草黄酮醇合酶(Flavonol synthase,FLS)基因的生物学功能,从普通烟草K326中鉴定了NtFLS基因家族成员,并进行了基因结构、系统进化、蛋白结构等生物信息学分析,分析了NtFLS所有成员在烟草不同组织中的表达模式,以及NtFLS1和NtFLS2基因在不同激素和非生物胁迫条件下的表达水平。结果表明:①普通烟草基因组中含有9个NtFLS基因,其编码蛋白均含有2OG-FeII_Oxy和DIOX_N保守结构域,属于双加氧酶(2-oxoglutarate dependent dioxygenase,2-ODD)超家族。其中,NtFLS1和NtFLS2蛋白含有FLS家族的特异性序列,且分别与绒毛状烟草NtomFLS和林烟草NsylFLS亲缘关系较近。②在烟草盛花期不同组织中,NtFLS1和NtFLS2基因的表达水平均明显高于其他7个NtFLS基因,且在花蕾、雄蕊和雌蕊中表达水平较高,表明NtFLS1和NtFLS2具有较高的转录活性,可能在烟草雄蕊和雌蕊发育过程中发挥重要的调控作用。③NtFLS基因启动子中含有多个激素和非生物胁迫响应元件,且NtFLS1和NtFLS2基因的表达受多种激素和非生物胁迫的显著调控,表明NtFLS1和NtFLS2蛋白可能参与调控烟草对激素与非生物胁迫的响应。

转外源法呢基焦磷酸合酶基因烟草抗赤星病研究

将已克隆的薄荷(Mentha spicataL.)法呢基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,fps)的cDNA插入载体,构建CaMV35S启动子驱动下的植物表达载体pBinARfps。用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg/L Kan的MS+0.1 mg/L IAA+1.5 mg/L BA培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg/L Kan的MS培养基上生根,再生植株。Kan阳性植株经PCR-Southern检测筛选,得到5株PCR阳性植株(K-4,K-6,K-17,K-19,K-35),证明外源fps基因在烟草基因组中的整合;Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;离体叶片接种实验表明,转基因植株(T1代)对赤星病抗性明显提高。这表明fps基因在植物抗病基因工程中具有潜在应用价值。

水稻OsMGD2和OsMGD3基因的功能鉴定及其对烟草耐低磷胁迫的影响

【目的】单半乳糖甘油二酯合酶(MGD)是合成单半乳糖甘油二酯(MGDG)的关键酶,在植物响应低磷胁迫过程中起着重要作用。为系统了解水稻OsMGD2和OsMGD3基因在低磷胁迫响应中的作用和功能。【方法】用盆栽试验分析正常和低磷条件下野生型(SR1)、过表达OsMGD2和OsMGD3转基因烟草的生理响应及脂质组分的变化。【结果】无论在正常还是低磷条件下,转基因与野生型烟草的磷含量无显著差异,但转基因烟草的生物量、叶绿素含量和光合能力均显著高于野生型。转基因烟草在低磷胁迫下的磷脂(PL)含量、双半乳糖甘油二酯(DGDG)含量、DGDG与MGDG的比值和半乳糖脂(GL)与PL的比值均显著高于野生型烟草,且OsMGD3转基因烟草的脂质含量和比值均高于OsMGD2转基因烟草。【结论】通过调控水稻OsMGD2/3基因表达,可提高植物低磷下的膜脂重塑能力,进而维持植物在低磷胁迫下较高的光合和生长能力,增加植物的低磷耐受性。

烟草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以烟草品种K326叶片总RNA为模板扩增出烟草法呢基焦磷酸合酶基因fps,克隆至载体PMD19-T中。序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长702 bp,共编码234个氨基酸残基,其核酸序列与玉米、杜仲、拟南芥、青蒿、Nicotiana sanderae×Nicotiana langa-dorffii杂交种的法呢基焦磷酸合酶基因的核酸序列同源性分别为74%,76%,77%,80%和97%。

光诱导和组成型启动子控制柠檬酸合酶基因过量表达对转基因烟草耐铝性影响的比较

分别用光诱导型启动子（PrbcS）和组成型启动子（Ca MV35S）驱动柠檬酸合酶基因（cs）在转基因烟草中过量表达,比较转基因烟草中柠檬酸的含量和分泌量及其铝耐受性的变化.结果表明：诱导型转基因株系的CS酶活性是野生型的2.3~2.4倍,组成型转基因株系的酶活性是野生型的1.6~2倍;在30μmol·L-1铝胁迫下,诱导型转基因植株的根相对伸长量是野生型的2.8~2.9倍,组成型的根相对伸长量是野生型的2~2.3倍;在无铝或300μmol·L-1铝胁迫下,转基因烟草叶片和根中柠檬酸含量均高于野生型,其中诱导型转基因植株叶片中柠檬酸含量高于组成型转基因植株,转基因烟草柠檬酸的分泌量分别是野生型的1.8~2.0倍和3.0~3.3倍;在有铝胁迫的珍珠岩基质上培养时,转基因烟草的生长情况好于野生型.这些结果证明,与Ca MV35S相比,采用PrbcS启动子控制cs基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量,同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量,从而增强其对铝毒害的抵御能力.

根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化

【目的】研究根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化条件。【方法】以＂中烟99＂叶片为受体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens,GV3101）介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组,并对其遗传体系进行了优化,对筛选获得的转基因烟草植株进行检测。【结果】根癌农杆菌介导的芪合酶基因遗传转化的最佳条件为：将预培养2 d的烟草外植体,用稀释10倍的GV3101菌株菌液（OD600=0.6）浸染8 min后,共培养3 d,然后转入含卡那霉素（Km）50 mg/L和羧苄青霉素（Cb）500 mg/L的筛选分化培养基上诱导分化,待抗性芽长到2～3 cm后,转入含Km 50 mg/L和Cb 500 mg/L的筛选生根培养基上进行筛选,在以上最佳遗传转化条件下,初步筛选到54株转化体,经PCR和RT-PCR检测获得25株转化烟草植株。【结论】经卡那霉素筛选、PCR、RT-PCR检测后,初步证明芪合酶基因已被整合到烟草基因组中,并可以正常转录。

普通烟草茄尼基焦磷酸合酶基因NtSPS的克隆和表达分析

为揭示烟草茄尼基焦磷酸合酶(Nicotiana tabacum solanesyl diphosphate synthase,NtSPS)在烟草茄尼醇生物合成中的作用,分离了烟草品种红花大金元茄尼醇生物合成关键基因NtSPS1和NtSPS2,并对其进行了序列比对、进化分析和亚细胞定位分析,研究了其在烟草植株不同器官的表达水平以及烟草植株不同器官的茄尼醇、叶绿素含量与NtSPS表达水平的相关性。结果表明,NtSPS1和NtSPS2开放读码框(ORF)大小分别为1209、1206 bp,分别编码402、401个氨基酸;NtSPS1和NtSPS2均存在2个保守的DDxxD结构域,这与NtSPS功能发挥相关;NtSPS1、NtSPS2与番茄SPS同源性较高,这与烟草、番茄均为茄科作物有关;NtSPS1、NtSPS2均定位于叶绿体中;烟草植株不同器官NtSPS1和NtSPS2表达水平排序为:叶>茎>根,这与茄尼醇、叶绿素在烟草植株中的分布规律一致。本研究可为NtSPS调控烟草茄尼醇生物合成机制的深入研究奠定基础。

核基质结合区对转爬山虎芪合酶基因烟草中产生白藜芦醇的作用

采用核基质结合区(MARs)来提高转芪合酶基因(STS)烟草(Nicotiana tabacum L．)中白藜芦醇产物的含量。MARs是细胞中能与核基质特异紧密结合的DNA片段，体外结合实验表明克隆自酵母的MARs序列能特异地与烟草核基质结合。芪合酶是白藜芦醇生物合成中的关键酶，用RT-PCR方法从川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana(Hemsl．)Dielset Gilg)中克隆了与葡萄芪合酶基因有较高同源性的芪合酶编码区，将其置于CaMV35SΩ强启动子下，分别构建两侧带有MARs及不含MARs序列的表达载体，通过农杆菌介导转化烟草。Northern blot及HPLC等分析表明STS基因已整合至烟草染色体中并正常转录，且表达的外源芪合酶在烟草中可催化其底物合成白藜芦醇产物。与对照相比，MARs的存在使转芪合酶基因烟草中白藜芦醇的含量平均提高了约一倍。MARs在转芪合酶基因植物中的应用也为获得抗病性更强、白藜芦醇含量更高、更保健的转基因果蔬的研究奠定了基础。

怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转录PCR进行克隆,序列分析采用生物信息学进行分析,器官表达采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行比较。【结果】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因cDNA总长度为987 bp,G+C含量为47.92%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶由329个氨基酸组成,分子量37578.03 Da,理论等电点5.39,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的比例分别占27.66%、21.88%和50.46%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶主要存在内质网中,在进化上与山甜菜(Nekemias grossedentata)、河岸葡萄(Vitis riparia)和葡萄(Vitis vinifera)的亲缘关系较近,尤其是与山甜菜(N.grossedentata)黄酮醇合酶在进化上具有最高的亲缘关系。qRT-PCR分析结果表明,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达在2个栽培种中存在器官特异性表达,怀玉2号在根中的相对表达量最高,怀玉1号在茎中的相对表达量最高。【结论】怀玉山三叶青黄酮醇合酶具有典型黄酮醇合酶的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,且怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达存在组织器官差异性。

桑树二氢黄酮醇-4-还原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表达谱及其与花青素含量的关系

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和花青素合酶(ANS)是植物花青素生物合成途径的2个重要酶类。从鲁桑品种育711号植株中克隆得到MmDFR和MmANS基因,生物信息学分析表明,MmDFR基因的ORF长度为1011 bp,编码336个氨基酸,预测蛋白质分子质量为3951 kD,等电点为534;MmANS基因ORF的长度为1077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为42.23 kD,等电点为5.25;MmDFR和MmANS蛋白的氨基酸序列有很高的保守性。qRT-PCR检测结果表明,MmDFR和MmANS在不同桑种质成熟桑椹中的表达丰度存在显著差异,在同一品种中随着果实成熟,基因的表达水平逐渐提高。结合对桑椹花青素含量的检测,表明桑椹花青素含量与MmDFR和MmANS基因的表达量呈正相关,推测MmDFR和MmANS在桑椹花青素合成途径中具正向调控作用。

芪合酶基因的遗传转化及其转基因烟草抗根黑腐病的研究

【目的】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法获得转芪合酶基因烟草,改良烟草对根黑腐病的抗性。【方法】以普通烟草品种"97204"叶片为受体,采用根癌农杆菌介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组并进行分子检测,利用灌根法对4株转芪合酶基因烟草植株接种烟草根黑腐病菌,观察烟草地上部分和根部的变化,并测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)活性。【结果】通过根癌农杆菌介导、抗性选择和分子检测,获得32株转芪合酶基因烟草。从中选取长势一致的4株转基因烟草用于抗病性鉴定,结果表明,2株在灌根接种后生长正常,另外2株在接种第7天时出现轻微黄化,3株根部无发病症状,另外1株在接种16d后根部出现发黑症状,而对照植株接种后第3天叶片就出现黄化及萎蔫症状,随着接种时间的延长,叶片黄化加剧,到第7天时已出现明显的发病症状,15d植株几乎死亡;转基因烟草PAL及PPO活性本底均显著高于对照,PAL活性在接种后4～10d保持在一个较高的水平,10d后又迅速下降,PPO活性在接种2d后迅速升高,在接种6d达到峰值,之后开始缓慢下降,而非转基因烟草PAL、PPO活性与转基因烟草相似,但变化幅度较小。【结论】用于抗性鉴定的4株转芪合酶基因烟草中,有3株对烟草根黑腐病的抗性较好。

烟草ATP合酶F_0部分4个亚基基因转录本编辑位点分析

RNA编辑是高等植物线粒体基因转录后表达调控的一种重要方式。为探究ATP合酶F_0部分的4个亚基基因与植物雄性不育性的关系,本研究以3个烟草雄性不育系(MS中烟90、MS云烟85和MS K326)及其同型保持系为供试材料,比较分析atp6、atp9、orf25和orf B线粒体基因转录本的编辑位点。结果表明,orf25和orf B基因转录本在不育系和保持系中发生的编辑位点是一致的。atp6基因在不育系中未发生编辑,在保持系中共有6处发生了RNA编辑。与保持系相比,atp9基因在不育系中除8处共同的C→T编辑外,还缺少2个C→T的特异编辑位点,其中1个导致氨基酸类型的改变。推测不育胞质因缺少特异的线粒体基因转录本编辑而导致烟草的细胞质雄性不育。

苦荞黄酮醇合酶基因FtFLS4的克隆及其在大肠杆菌的表达

【目的】克隆苦荞FtFLS4基因,深入研究其酶学活性。【方法】根据苦荞转录组数据克隆FtFLS4基因,对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-FtFLS4并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行活性鉴定。【结果】FtFLS4基因的cDNA为1 026 bp,编码341个氨基酸,编码蛋白具有属于α-ODD家族中黄酮醇合酶的结构特征,且其三维模型能与3种二氢黄酮醇底物进行分子对接;FtFLS4在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,酶学分析表明该重组蛋白具有将二氢黄酮醇催化为黄酮醇的活性。【结论】克隆得到FtFLS4基因,实现其在大肠杆菌中有活性的表达。

法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建

以留兰香(MenthaspicataL)为材料,利用RT PCR方法克隆法呢基焦磷酸合酶基因(fps)的cDNA,核酸序列分析表明,该基因的编码区长1050bp,编码349个氨基酸.进一步将fps基因插入植物表达载体BinAR,酶切鉴定及测序结果都证明fps的植物双元表达载体构建成功,为fps基因在烟草中的异源表达奠定了基础.

转fps基因烟草纯合系的获得及其特性分析

携带有外源法呢基焦磷酸合酶(fps)基因和卡那霉素抗性基因(NptII)的烟草种子在含卡那霉素(300mg/L)的培养基上能够正常地萌发和生长,对照种子虽能萌发,但幼苗形态与对照有着明显的差异。转fps基因植株所具有的卡那霉素抗性和与其抗病性之间密切相关,由此建立了一种鉴定转基因烟草后代纯合度的简易方法,得到4个fps转基因烟草纯合系(K4、K6、K17、K35),并对其农艺性状、田间抗性、化学成份和品质进行了评估,其中K4转基因品系的综合性状较原有品种有所提高。

辣椒CaDXS和CaPDS基因沉默的表型比较

【目的】沉默辣椒CaDXS和CaPDS基因,比较分析两者白化表型的差异,寻找新的辣椒沉默标记基因。【方法】利用双酶切克隆技术构建CaDXS和CaPDS基因的沉默载体;通过农杆菌介导转化侵染辣椒,观察辣椒的沉默表型;采用实时荧光定量PCR技术检测CaDXS和CaPDS基因的沉默效率。【结果】农杆菌浸润21 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现褪绿症状,沉默CaPDS基因的辣椒叶片出现白化。农杆菌浸润30 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现较为明显的白化;沉默CaPDS基因的辣椒叶片白化程度加剧,新叶近乎白化。与CaDXS基因相比,沉默CaPDS基因导致的辣椒白化表型更明显和高效。沉默组辣椒叶片中CaDXS和CaPDS基因的表达量均显著降低(P<0.05),沉默效率分别为86.80%和93.08%,表明辣椒CaDXS和CaPDS基因被成功沉默。【结论】CaDXS基因可以作为辣椒的沉默标记基因,但沉默CaPDS基因的辣椒白化表型出现更早且明显,因此,CaPDS基因比CaDXS基因更适合作为辣椒沉默标记基因。

fps基因过量表达对烟叶类胡萝卜素生物合成的影响

为探索法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因过量表达对烤烟叶片类胡萝卜素生物合成的影响,利用RT-PCR技术,比较了4个fps转基因株系(K-4、K-6、K-17、K-35)及其非转基因对照中参与类胡萝卜素生物合成的关键酶基因的表达强度,并利用LC/MS技术,分析了叶片发育过程中类胡萝卜素及其各组分含量的变化规律。结果表明:外源fps在烟草中的过量表达,对烟叶类胡萝卜素合成相关基因Psy、Lycb皆有正向调节作用,但对Zds的表达影响不大;化学分析表明,fps转基因烤烟株系中,总类胡萝卜素及其各组分的含量在叶片不同发育期均高于未转基因K326对照株系。说明外源fps基因在烟草中的过表达,对类胡萝卜素生物合成具有促进作用。

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究。方法采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性。结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1 008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性。结论首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达。

黑果枸杞和宁夏枸杞中黄酮醇合酶基因的克隆及表达分析

黑果枸杞和宁夏枸杞为枸杞属中两种重要的药用植物,具有极大的药用价值。本研究利用转录组数据克隆了黑果枸杞和宁夏枸杞黄酮醇合酶基因(Flavonol synthase,FLS),分别命名为LrFLS及LbFLS,并通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR)分析其在两种枸杞果实四个发育时期中的表达模式。研究结果表明:LrFLS与LbFLS各编码一条由350个氨基酸残基组成的蛋白序列。蛋白序列分析表明:LrFLS、LbFLS相似度高达99%,各含有两个保守的功能域。进化分析表明,LrFLS和LbFLS同属茄科的烟草、马铃薯的FLS蛋白序列相似度最高。实时定量PCR结果表明,LrFLS在S2时期的表达量最高,在果实发育过程中呈现先升高后降低的趋势;而LbFLS在S2时期表达量最低,呈现先降低后升高的趋势。本研究为揭示黄酮醇在黑果枸杞和宁夏枸杞果实中的累积具有一定的启示作用。

fps转基因烤烟类胡萝卜素及其降解产物的研究

为探索法呢基焦磷酸合酶(fps)对烤烟中类胡萝卜素及其降解产物的影响,利用常规和GS/MS方法,对转fps基因烟草株系(K-4、K-6、K-17、K-35)烤后烟叶中类胡萝卜素含量及萜烯类香气物质含量进行了分析,结果发现,烤后烟叶类胡萝卜素含量有较大差异,与未转基因对照相比普遍有所提高,其中K-35含量最高;8种类胡萝卜素降解产物及茄酮、新植二烯含量有不同程度的提高,其中K-35香气降解产物含量整体较高,表明外源fps基因在烟草中的表达对类胡萝卜素合成具有促进作用,从而有利于烟叶品质的提高。