烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)生理小种鉴定技术研究

1981—1985年从全国8个主产烤烟省30个地、县共采集和分离到烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)57个分离物,用游动孢子悬浮液接种根及茎基部,试验表明这种接种方法效果为好。用此方法将各分离物接种在常用的Burley_(21)、Burley_(37)、N.nesophila、N.stocktonii等4个鉴别寄主上进行了鉴定试验。通过鉴定,采自全国57个分离物中有44个属于生理小种Ⅰ号,占77.2%;有12个属于生理小种0号,占21.1%,还有个别分离物有待进一步鉴定。

烟草黑胫病菌拮抗内生细菌的筛选和鉴定

为寻找防治烟草黑胫病新途径,2001至2003年,从湖南永州和宁乡等地烟草黑胫病发病严重的田块采集健株,共分离到内生细菌株120株,经测定,8株内生细菌菌株在室内有较强的拮抗作用,这8株内生细菌与烟草黑胫病菌共培结果显示,55y,NN-3,YN-4和YN-10对烟草黑胫病菌抑菌效果均在66%以上.根据内生细菌形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生细菌55y为假单胞杆菌属铜绿假单胞菌,NN-3为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌,YN-4,YN-10为芽孢杆菌属凝结芽孢杆菌,且这4菌株均为烟草内生细菌.

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotianabenthamiana),并对转基因烟草T0和T1代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytoph-thoraparasiticavar.nicotianae)、赤星病菌(Alternariaalternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。

玉米根系分泌物对烟草黑胫病菌的抑制活性及其抑菌物质分析

本文研究了玉米根系与烟草疫霉菌游动孢子的互作及玉米根系分泌物对烟草疫霉菌各个生育阶段的抑菌活性,并利用HPLC-MS分析了根系分泌物中具有抑菌活性的物质。结果表明,玉米根系能吸引烟草疫霉菌游动孢子,其分泌物也能使孢子休止并裂解。进一步研究表明,玉米根系分泌物对烟草疫霉菌游动孢子的释放、休止孢萌发及菌丝生长均具有明显的抑制活性,在浓度0.90 mg/m L时抑制率分别为73.8%、87.2%和55.2%。HPLC-MS分析结果表明,根系分泌物中存在苯并嗪类化合物丁布及其降解产物门布,其中门布对烟草疫霉菌菌丝的生长具有明显的抑菌活性,浓度0.30 mg/m L时抑制率达90.94%。综上所述,玉米根系既能吸引游动孢子,又能分泌对烟草疫霉菌具有抑制活性的苯并嗪类化合物。该结果对合理利用玉米与烤烟轮作控制烟草黑胫病的发生具有重要意义。

大蒜粗提物对烟草黑胫病菌的室内抑制作用

采用平板抑菌法测定了大蒜乙醇和水提取物对烟草黑胫病菌的抑菌效果。结果表明:大蒜提取物对烟草黑胫病菌有显著抑制作用,且随大蒜提取物浓度的增大而增强;大蒜乙醇提取物对烟草黑胫病菌的抑制作用优于水提取物。0.2g/mL和0.3g/mL浓度大蒜乙醇提取物对烟草黑胫病菌的抑制率均为100.00%;而0.3g/mL浓度的大蒜水提取物的抑制率亦为100.00%;大蒜水提取物与乙醇提取物的有效抑制中浓度分别为0.04g/mL和0.03g/mL。因此,可尝试以大蒜为原料研制植物保护剂来防治烟草黑胫病。

烯酰吗啉对我国烟草黑胫病菌的毒力研究

从山东和云南烟区采集分离了20个烟草黑胫病菌phytophthora parasitica vat．nicotianae菌株，采用菌丝生长速率法测定了烯酰吗啉对这些菌株的毒力。结果表明：20个田间菌株的EC50值在0．60-1．28μg/mL之间，与实验室保存的敏感菌株（S）的EC50值（0．32μg/mL）相比，毒力倍数在1．87—4．00之间．均属于敏感菌株。烯酰吗啉对烟草黑胫病菌孢子囊的产生有明显的抑制作用，8．00μg/mL的烯酰吗啉对孢子囊产生的抑制率为100％。通过烯酰吗啉对烟草黑胫病菌继代培养物的毒力比较证明，烟草黑胫病菌对烯酰吗啉存在抗性风险。

烟草黑胫病菌厚垣孢子和菌丝体在土壤中的存活状态

将实验条件下制备、提取的黑胫病菌厚垣孢子、菌丝体悬浮液定量加入含水量分别为４０％和７０％的灭菌土壤中，分别于４℃、２５℃和室温下保存，定期检测。结果表明：厚垣孢子在各处理土壤中至少可存活８个月，主要以细胞壁加厚、原生质浓缩的休眠状态存活，而菌丝体只能单独在土壤中存活２个月。在土壤中存活３个月内的厚垣孢子可用选择性培养基直接分离检测，３个月后需用诱捕的方法才能检测出来。温度对厚垣孢子、菌丝体的存活影响明显，低温有利两者的存活，不同含水量对两者的存活影响不明显。

抗烟草黑胫病菌的植物源杀菌剂的筛选研究

以烟草黑胫病菌为供试菌种,对7种植物的95%乙醇提取物进行离体生物测定筛选。结果表明,相对其它植物,中草药F和中草药H对烟草黑胫病菌有显著的抑菌活性。进一步毒力测定表明,中草药F和中草药H提取物对烟草黑胫病菌的3 d后的EC50值分别为1.53和0.79 g.L-1,5 d后的EC50值分别为1.32和0.59 g.L-1。

湖北省烟草黑胫病菌生理小种研究初报

在湖北省襄樊、恩施等主要烟区采集烟草黑胫病病株样本111个,分离纯化出30个烟草黑胫病菌株。采用游动孢子悬浮液注射接种鉴别寄主和TTZ(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)颜色反应两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明,供试的30个菌株在TTZ培养基中的反应皆为红色,有24个菌株在鉴别寄主反应中对L8和NC1071有较强致病力,而对N.nesophila无致病力,应为1号生理小种,占供试菌系的80%,为湖北省优势生理小种;其他6个菌株中有4个菌株对NC1071有较强致病力,但对L8致病力较弱,有1个菌株对L8和NC1071致病力较弱;1个菌株对NC1071致病力较弱,但对L8有较强致病力;6个菌株对N.nesophila无致病力,是否为2号生理小种还是其他致病型,尚待进一步研究确定。

烟草黑胫病菌研究进展(一)

系统综述了烟草黑胫病菌的发现与命名、分类、生物学特征、分布与为害、致病机理、生理特性及寄主范围等方面的最新研究进展。

烟草黑胫病菌的分离及培养性状研究

烟草黑胫病是烟草(Nicotiana tabacum)的一种毁灭性病害。试验采集云南省昭通市的烟草黑胫病病株,采用组织分离法对病原菌进行分离、纯化,对其培养性状进行研究。结果表明,燕麦培养基适合烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica)的培养,菌丝生长旺盛;烟草黑胫病菌菌丝粗细不均匀,无隔膜,具有膨大体;孢子囊顶生,具脱落性,具1个或2个乳突。这些培养性状与前人研究结果相似,表明烟草黑胫病菌的培养性状较为稳定。

烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性测定

烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavarnicotianae)对甲霜灵的敏感性测定结果表明:所测菌株菌丝生长对甲霜灵都存在不同程度的敏感性,Ec50值平均为0.2132μg/mL,Ec95值平均为6.5623μg/mL,但不同菌株对甲霜灵的敏感性不同,Ec50值范围在0.0573～0.8485μg/mL之间,相差15倍左右。Ec95值的范围在2.3393～21.8051μg/mL之间,相差9倍左右。其中以9734-1、9716-3和9706-2的耐药性最明显。甲霜灵对烟草黑胫病菌孢子囊的产生也有明显的抑制作用,5.0μg/mL的甲霜灵对烟草黑胫病菌的产孢抑制率为100%。通过甲霜灵对烟草黑胫病菌继代培养物的测定也证明了烟草黑胫病菌对甲霜灵的耐药性。

广西烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性检测

【目的】研究广西烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性,为烟草黑胫病药剂防治提供科学依据。【方法】采用菌落生长速率法对从广西主要烟区采集分离到的196株烟草黑胫病菌株进行对甲霜灵的敏感性测定。【结果】甲霜灵对196株菌株的EC50在0.0691-1.0243μg/mL,平均EC50为0.3618±0.0297μg/mL;来自田林县的菌株TL05为最敏感菌株,EC50为0.0691μg/mL;来自靖西县画洞镇的菌株ZXHD12为最耐药菌株,EC50为1.0243μg/mL;各烟区烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性有一定差异,其中南丹、田林县的菌株较敏感,而隆林、靖西、德保、富川县的部分菌株较耐药;196株菌株中,敏感型、一般耐药型和耐药型菌株分别占1.53%、66.84%和31.63%。【结论】广西烟草黑胫病菌已对甲霜灵产生不同程度的抗性,甲霜灵作为生产上防治烟草黑胫病的主要药剂具有较大的风险,建议生产上甲霜灵与其他杀菌剂进行轮换使用。

毕节地区烟草黑胫病菌对甲霜灵抗药性的初步检测

为了解烟草黑胫病菌对甲霜灵产生的抗药性,采用菌落生长测定法,对从贵州省毕节地区5个县分离的9株烟草黑胫病菌进行了抗性测定。结果表明:烟草黑胫病菌菌丝生长对甲霜灵均存在不同程度的敏感性,EC50值平均为0.7 158μg/mL,其中,CGch-2的耐药性最强,EC50值为1.225 3μg/mL。毕节地区的烟草黑胫病菌已经对甲霜灵产生了抗性。

黑胫病菌诱导的烟草SSH文库构建及其分析

黑胫病是危害严重的世界性烟草主要病害之一,探究烟草对黑胫病的抗病机制,可以为该病的综合防治提供理论依据。本研究以烟草黑胫病抗性品种革新3号为材料,利用黑胫病0号生理小种诱导其水平抗性,分别在接种后0.5、1、3、6、10和16d取样,通过抑制差减杂交技术(SSH)构建cDNA文库,获得了960个阳性克隆。利用反向Northern斑点杂交技术对其中240个阳性克隆进行杂交筛选,筛选出57个表达差异明显的基因,序列拼接后获得33条高质量EST,测序及其比对分析表明,革新3号对烟草黑胫病抗性相关基因主要涉及抗病防卫、光合作用、信号传导和能量代谢等方面。进一步基因功能分析显示,病程相关PR1b蛋白、半胱氨酸蛋白、延伸因子1-α、α-微管蛋白、细胞色素P450、精胺合成酶、水通道蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、甘氨酸延伸因子等可能参与了烟草与黑胫病菌非亲和互作过程。

烟草黑胫病菌株亲缘关系的RAPD分析

从２２０个ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡｓ）随机引物中所选出的多态扩增性强的２１个引物对来源不同的刀个烟草黑胫病菌株进行全基因组ＤＮＡ遗传多样性分析和指纹构建。选用引物对受试菌株进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增，共产生２４３条ＤＮＡ标记图带，其中１９１条为多态性图带，多态检测率为７８．６％。利用ＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｔｈｔｅＰａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ＭｅｔｈｏｄＷｉｔｈＡｒｉｔｈｍｅｔｉｃ Ａｖｅｒａｇｅ）软件对受试菌株间的遗传距离进行聚类分析构建系统树状图，受试对个菌株被划分为５个遗传聚类组即（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。结果证明供试菌株具有丰富的遗传多样性，虽各自的遗传背景差异显著，但其亲缘关系相近，遗传聚类组的划分与菌株的地理来源未有明显的相关性。

河南省烟草黑胫病菌生理小种鉴定

在河南省宜阳、登封、渑池等15个烟叶主产区分离到烟草黑胫病菌36个,采用TTZ颜色反应和游动孢子悬浮液注射接种鉴别寄主两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明:36个菌株在TTZ培养基上均呈现红色反应,有32个菌株对L8和NC1071都有较强的致病力,将其鉴定为1号生理小种,占供试菌株的88.9%,为河南省烟草黑胫病菌的优势小种;其他4个菌株有1个菌株对L8无致病力,2个菌株对其致病力较弱,1个菌株对NC1071无致病力,生理小种类型尚未确定。

银法利和烯酰吗啉对烟草黑胫病菌的毒力测定及田间防治试验

采用菌丝生长速率法测定了银法利(氟吡菌胺+霜霉威盐酸盐)、烯酰吗啉对7株来自广西不同烟区、对甲霜灵敏感性不同的烟草黑胫病菌的毒力,结果表明银法利、烯酰吗啉对7个烟草黑胫病菌株均具有很好的抑制作用,EC50值范围分别为1.1090～1.9661、0.6218～1.0625 mg/L,两者对甲霜灵敏感型、一般耐药型、耐药型的菌株的毒力无明显差异,说明它们与甲霜灵没有交互抗性。盆栽试验表明银法利和烯酰吗啉对耐甲霜灵菌株引起的黑胫病有良好的防治效果。2008～2010年的田间防治试验结果显示,68.75%银法利悬浮剂和50%烯酰吗啉可湿性粉剂对烟草黑胫病具有很好的防效,显著优于常用药剂68%精甲霜灵.代森锰锌水分散粒剂的防效。

不同类型杀菌剂对烟草黑胫病菌生物活性的研究

研究了烯酰吗啉、嘧菌酯、醚菌酯、甲霜灵及代森锰锌5种不同类型杀卵菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长、孢子囊产量、游动孢子释放、孢子囊直接萌发及休止孢萌发的生物活性。结果表明:烯酰吗啉和甲霜灵对菌丝生长具有强烈的抑制作用,其次为代森锰锌,嘧菌酯和醚菌酯的活性最低;烯酰吗啉和甲霜灵对孢子囊的形成也具有很高的抑制活性,显著高于其它类药剂;游动孢子的释放对嘧菌酯和醚菌酯最为敏感,其次为代森锰锌,而烯酰吗啉和甲霜灵对其没有抑制作用;孢子囊的直接萌发对嘧菌酯和醚菌酯最为敏感,其次为烯酰吗啉和代森锰锌,而甲霜灵对此阶段没有活性;休止孢的萌发对嘧菌酯和醚菌酯最为敏感,其次为烯酰吗啉、代森锰锌,而甲霜灵不影响其萌发。