β-烟酰胺单核苷酸对氧糖剥夺PC12细胞自噬的影响

为了探讨β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)诱导的PC12细胞自噬的影响及其可能机制。通过体外建立OGD PC12细胞自噬损伤模型,MTT法检测各组细胞存活率。透射电镜观察NMN处理后的自噬小体及溶酶体,MDC荧光染色观测NMN对自噬小体的影响。Western blot检测LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、P-mTOR/mTOR等自噬相关蛋白表达水平。结果显示,与Con比,OGD组细胞存活率显著降低(P<0.01),自噬小体及自噬溶酶体增多(P<0.01),MDC荧光斑点及强度增强(P<0.01),Beclin1、LC3-II/LC3-I表达量显著上调(P<0.01),p62、P-mTOR/mTOR表达量显著下调(P<0.01)。与OGD组比,NMN组细胞存活率显著提高(P<0.01),NMN组和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组自噬小体及自噬溶酶体减少(P<0.01),MDC荧光斑点及强度减弱(P<0.01),Beclin1、LC3-II/LC3-I表达量下调(P<0.01),p62、P-mTOR/mTOR表达量上调(P<0.01),而雷帕霉素(rapamycin,RAPA)组则与之相反。与RAPA组相比,RAPA+NMN组自噬小体及自噬溶酶体显著减少(P<0.01),MDC荧光斑点及强度减弱(P<0.01),Beclin1、LC3-II/LC3-I表达量显著下调(P<0.01),p62、P-mTOR/mTOR表达量显著上调(P<0.01)。因此,NMN可抑制OGD诱导的PC12细胞自噬损伤,发挥抗神经元自噬损伤的保护作用,并且这种保护作用可能与mTOR相关通路有关。本研究可为NMN防治OGD诱导的细胞自噬损伤提供一定的靶标参考,为天然化合物的开发累积一定实验室数据。

β-烟酰胺单核苷酸霜在经皮护理中的功效机制

为探究实验室制备β-烟酰胺单核苷酸(NMN)霜的生物功效,借助小鼠光老化模型和自然衰老模型对NMN霜的抗衰老作用及生物安全性进行了评估。结果显示,NMN霜可以通过提高皮肤及血液中抗衰老因子(NAD+和SIRT3)、上调血液中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力及促进皮肤胶原纤维生成达到抗衰老效果;NMN霜治疗组小鼠的血液指标及五脏H&E染色结果相比对照组均无异常,提示NMN霜的生物安全性较高。

高效液相色谱法同时测定烟酰胺单核苷酸中5种有关物质

目的构建同时检测烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)中5种有关物质[烟酰胺氧化物、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)及烟酰胺]含量的高效液相色谱法。方法采用C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液(用磷酸调节pH为4.5)-甲醇为流动相进行梯度洗脱,流速为1 mL/min,进样量为20μL,检测波长210 nm,柱温20℃,试样盘控温:5℃,并对方法的专属性、灵敏性、准确性、重复性、耐用性及适用性进行验证。结果烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP及烟酰胺分别在质量浓度0.4060~16.2402、0.4110~16.4403、0.4150~16.6010、0.4163~16.6507、0.4028~16.1206μg/mL范围内,质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系,线性系数r^(2)值均大于0.998;加标回收率范围分别为98.5%~102.6%、95.6%~104.1%、98.9%~104.6%、100.0%~102.8%、100.6%~101.3%;3批样品中5种杂质含量检测结果分别为0.18%、0.20%、0.16%、0.14%、0.26%;5种杂质的检出限范围为0.04028~0.04163μg/mL,定量限范围为0.4028~0.4163μg/mL,灵敏度高;专属性、重复性和耐用性均良好。结论该方法简便易行、适用性广,适用于NMN中5种有关物质的检测,为提升其质量标准奠定基础,为食品安全提供保障。

烟酰胺单核苷酸醇沉干燥工艺研究及微观结构观察

利用烟酰胺单核苷酸微溶于醇类的性质,对醇沉分离纯化烟酰胺单核苷酸的工艺操作条件进行优化,结合真空干燥的方式获得符合标准的烟酰胺单核苷酸。以烟酰胺单核苷酸含量、纯度、收率和水分为指标,考查醇沉温度、醇沉时间等因素,确定烟酰胺单核苷酸的最佳醇沉工艺和干燥工艺,得到烟酰胺单核苷酸的最佳醇沉工艺为取15 g/L的烟酰胺单核苷酸溶液,加入乙醇,使乙醇体积分数达到70%,4℃搅拌1 h,离心得到烟酰胺单核苷酸湿固体,在-0.08 MPa和50℃条件下干燥所得产物的收率最高且水分和纯度达标。利用扫描电镜观察微观结构,分析该工艺制备烟酰胺单核苷酸的可靠性。该优选工艺稳定可靠,可用于烟酰胺单核苷酸的分离纯化。

高效毛细管电泳法测定金针菇提取物中β-烟酰胺单核苷酸含量的初步研究

金针菇既是一种美味食品,又是较好的保健食品,营养成分十分丰富,建立了金针菇提取液中β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)的高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE-DAD)含量测定方法。试验结果表明,检测波长218 nm,运行缓冲液30 mmol·L^(-1)硼砂缓冲液和10 mmol·L^(-1)磷酸二氢钠缓冲液(pH 9.2),分离电压25 kV,进样时间为5 s时,该方法能够检测到金针菇提取液中的β-烟酰胺单核苷酸,检测限为0.17μg·mL^(-1),并在0.03~2.00 mg·mL^(-1)范围内呈较好的线性关系,利用标准曲线获得回归方程y=2E+6x-345.69,R2=0.9994,将金针菇图谱中的相应β-烟酰胺单核苷酸(NMN)峰面积带入回归方程,计算得β-烟酰胺单核苷酸含量为27.57μg·mL^(-1)。方法学考察结果表明β-烟酰胺单核苷酸标准品迁移时间和峰面积相对偏差为0.68%和1.44%;且样品8 h内的迁移时间和峰面积的相对偏差分别为1.26%和2.82%;β-烟酰胺单核苷酸在金针菇样品中的回收率为89%~94%。结果表明该方法适用于金针菇提取液中β-烟酰胺单核苷酸的测定,为食用菌中β-烟酰胺单核苷酸含量的测定提供了新的方法。

大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化

烟酰胺单核苷酸(NMN)是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Sfnampt)、磷酸核糖焦磷酸激酶(Tkprs)和核糖激酶(Erbks)。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45、50和37℃,最适pH值分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35℃热稳定性良好而在40~55℃较差;Tkprs在40~60℃热稳定性良好;Erbks在25~40℃热稳定性良好而在45℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65μmol/(L·min)、2.37μmol/(L·min)、12.58μmol/(L·min),Km分别为2.87μmol/L、25.48μmol/L和74.13μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37℃、pH值8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50μmol/L的NMN。该研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。

一锅法全细胞催化合成烟酰胺单核苷酸的研究

对以腺苷酸(Adenosine monophosphate,AMP)为底物合成β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononucleotide,β-NMN)的途径进行了研究。在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中构建AMP核苷酶(AMN)与磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)的共表达及融合表达体系,其中,融合菌株PRS-L4-AMN与烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)构成的双菌催化体系具有较高的催化效率,是三菌混合催化体系的2.42倍。进一步对全细胞催化合成NMN的反应体系进行优化,包括pH、温度、缓冲液、金属离子及菌粉投加量等。结果表明,在优化条件下,反应2 h时NMN产量达到最高,为23.7 mmol/L,总收率达33.4%,实现了NMN的一锅法生物合成。

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中的烟酰胺单核苷酸α、β异构体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

目的建立固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)α、β异构体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)含量的方法。方法样品经5%甲醇水溶液超声提取,HLB固相萃取柱和混合型阴离子交换固相萃取柱分别净化,采用Waters ACQUITY UPLC?HSS T色谱柱进行分离,流动相为5 mmol/L乙酸铵含0.1%(V/V)甲酸水-甲醇,梯度洗脱;流速0.2 mL/min;柱温30℃;多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式定量分析,定量离子对NMN为m/z 335.0/123.0、NAD+为m/z 662.0/540.0。结果在最优条件下,α-NMN和β-NMN两种异构体的分离度为5.56。该方法中α-NMN、β-NMN和NAD+均在10~1000 ng/mL范围内线性良好,相关系数分别为0.9999,0.9998和0.9995。α-NMN、β-NMN和NAD+的检出限分别为4.0、2.0和1.0 ng/mL,定量限分别为10.0、5.0和3.0 ng/mL,回收率为93.8%~103.8%,相对标准偏差为2.1%~6.5%。结论该方法灵敏度高、选择性好、结果准确可靠,可同时快速检测各种基质食品中NMNα、β异构体和NAD+的含量。

褪黑素和烟酰胺单核苷酸对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的影响

【背景】目前关于褪黑素(melatonin,MLT)的研究多集中在家禽的生殖功能上,而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关,研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限,而共同处理的效果更为显著,虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道,但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制,为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞,并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞,在体外成熟培养基础上用1 ng·mL^(-1) MLT与1μg·mL^(-1) NMN分别单独或组合处理细胞24 h后,利用CCK-8检测细胞活力;为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制,通过构建MLT受体基因(MTNR1A、MTNR1B)的过表达载体,并与1 ng·mL^(-1) MLT共同处理细胞,采用qRT-PCR和Western blot实验技术研究过表达MTNR1A、MTNR1B是否影响MLT对增殖基因的促进作用;为了进一步探究MLT与NMN对鹅骨骼肌卫星细胞增殖相关基因的影响,采用qRT-PCR和Western blot实验技术检测骨骼肌细胞增殖相关基因的表达变化。【结果】骨骼肌卫星细胞的特异性标志蛋白Pax7和Desmin分别在细胞核和细胞质中呈绿色荧光的阳性反应,结果表明试验所用细胞为骨骼肌卫星细胞,CCK-8检测结果表示1 ng·mL^(-1) MLT与1μg·mL^(-1) NMN促进鹅骨骼肌卫星细胞活性,qRT-PCR和Western blot结果显示,与对照组相比,过表达MLT受体基因MTNR1A、MTNR1B后,增殖标志基因Pax7的mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05),抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05);另外,1 ng·mL^(-1) MLT和1μg·mL^(-1) NMN共同处理鹅骨骼肌卫星细胞后,增殖标志基因Pax7的mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05),抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05),其变化比NMN和MLT单独处理更为显著。【结论】MLT通过其受体促进骨骼肌卫星细胞增殖,NMN和MLT共同处理可以加强MLT对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的促进作用,也为MLT和NMN在家禽实际生产中的应用提供了新思路。

β-烟酰胺单核苷酸对生理机能影响的研究进展

我国处于亚健康状态的超重或肥胖人群与老龄化人口数量都在逐年上升。在衰老和肥胖过程中,细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD^(+))水平会发生系统性下降。NAD^(+)是细胞能量代谢、调节细胞机能、影响衰老的关键靶点,因此,通过补充NAD+前体以改善生理机能、延缓衰老已经成为目前研究热点。β-烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是动物体内NAD^(+)代谢的中间产物,也是目前最直接高效的NAD^(+)补充前体。但是NMN对生理机能存在多方面多器官的复杂影响,而且人体临床试验与动物实验结果并不一致,服用量也尚未确定。本文综述到目前为止NMN的动物实验和人体临床试验结果,旨在探究补充NMN对动物、人体生理机能的影响、机制及其适宜剂量和不良反应,以期为未来NMN研究与应用提供思路。

β-烟酰胺单核苷酸促秀丽隐杆线虫生长及其作用机制

目的:研究β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)对秀丽隐杆线虫生长的影响与作用机制。方法:将线虫随机分为空白对照组和不同质量浓度NMN实验组(0.1、0.5、1、5、10 mg/mL),通过测定线虫在成年后13 d内的体长变化以评估NMN对线虫生长的影响;基于转录组学探索NMN(1 mg/mL)促线虫生长的作用机制;并采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证测序结果。结果:经0.1、0.5、1、5、10 mg/mL NMN喂食线虫后,相较空白对照组,线虫的平均体长在4~13 d均得到显著增加(P<0.05)。转录组测序分析筛选出263个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),基因本体论(gene ontology,GO)分析发现这些DEGs主要涉及胶原蛋白参与的角质层发育和基于角质素的角质层蜕皮周期、基于胶原蛋白和角质素的角质层发育、胶原蛋白三聚体等与生长发育有关的生物学功能。对富集的关键GO中的DEGs构建蛋白互作网络图,并对筛选出的前10个关键核心基因进行qRT-PCR验证,结果基本与转录组一致。结论:NMN可能通过调节胶原蛋白和角质层相关基因的表达促进线虫生长。本研究为功能性食品、保健品等的开发提供了新的思路。

基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

本研究构建了分别含有烟酰胺核苷激酶(nicotinamideribosidekinase,NRK)和多聚磷酸酶(polyphosphatekinase,PPK)的双菌耦合发酵体系,实现了基于PPK的ATP再生系统在烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)生产中的应用。首先分别构建表达NRK1和NRK2的工程菌株,筛选得到高活性的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28a-NRK1,NMN产量5.17 g/L,产率77.4%;然后对NRK1的诱导表达条件进行优化,发现低温16℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.7 mmol/L、接种量3%、诱导时长22 h更利于蛋白的可溶性表达;进一步对E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系进行探索,发现在菌体质量浓度100 g/L、温度18℃、时间12 h、ATP与烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)浓度比1∶1.5时,NMN产量最高为5.73 g/L,产率85.78%;最后,通过对E. coli BL21(DE3)pET28a-PPK和E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1耦合发酵系统进行优化,得到最优体系为ATP与NR浓度比1∶3.5、菌体质量浓度比1∶2、发酵时间16 h,NMN产量达11.81 g/L。本研究所建立的高密度双菌耦合发酵产NMN工艺为高效、低成本的大规模发酵生产NMN开辟了新途径。

工程化大肠杆菌的烟酰胺单核苷酸生产及发酵优化

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN),是一种生物活性核苷酸,其在改善身体机能、修复运动损伤以及延缓细胞衰老等方面发挥积极作用。本研究以实验室先前保藏的大肠杆菌(Escherichia coli)Z1为出发菌株,经系统的代谢工程改造:削弱竞争途径、弱化产物降解途径以及增加底物葡萄糖的转化,获得一株能够有效生物合成NMN的工程菌株Z5,NMN的产量达到252.2 mg/L。在单因素实验的基础上,通过响应面法设计优化菌株Z5的发酵培养基成分,在最佳条件下的NMN产量为265.4 mg/L,相比出发菌株提高75.1%。随后,对菌株培养条件进行优化,最佳培养条件为pH=7.5,接种量4%,摇床转速150r/min。5L发酵罐的补料分批发酵,菌株Z5的NMN产量在发酵24 h达到4.21 g/L,烟酰胺转化率为48.7%。因此,经过对菌株的代谢工程改造和发酵条件优化,NMN的产量得到有效提升,为规模化生产NMN提供一定的参考价值。

酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸及关键酶

体内NAD^(+)会随着机体衰老出现系统性减少,从而引发年龄有关的生理功能下降和疾病发生.补充NAD^(+)的中间体β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononeucleotide,β-NMN),可有效平衡机体的NAD^(+)水平,改善衰老相关的病理和疾病状态.β-NMN作为抗衰老、治疗老龄性疾病的潜在活性物质,在食品和药品领域具有广阔的应用前景.与化学法相比,酶法合成β-NMN具有特异性强、高效、安全性高等优点,成为合成β-NMN的首选方法.现有酶催化合成β-NMN的路线报道不够全面,缺乏关于关键酶结构特征和催化特性等方面的研究报道.鉴于此,综述了β-NMN的4个酶催化合成路线及其关键酶的结构特征和催化特性,分析了不同酶法合成的优缺点及工业化应用的可行性.最后,讨论了现阶段酶催化合成β-NMN面临的难点和未来发展方向,以期为β-NMN的工艺优化和生产应用提供借鉴.

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与高血压

高血压是心脑血管疾病的首要危险因素,具有患病率高、致死率高和致残率高的特点。据统计,我国现有高血压患者达2.45亿[1]。庞大的患病群体给我国造成沉重的经济和社会负担。众所周知,高血压的发生发展受遗传、环境等多个因素影响,其中以年龄增长尤为明显。目前,对于高血压的发病机制尚未完全清楚[2-3]。从血管衰老的角度深入挖掘高血压潜在的发病机制,寻找高血压防治的新靶点和新策略,对遏制高血压井喷式增长的态势具有重要意义。

β-烟酰胺单核苷酸对反复着床失败患者子宫内膜基质细胞蜕膜化水平的影响

目的:探讨在体外受精-胚胎移植反复着床失败患者子宫内膜基质细胞中添加β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)对子宫内膜基质细胞蜕膜化水平的影响。方法:活检获得反复着床失败3例患者子宫内膜组织,酶消化分离体外培养后获得了三株原代子宫内膜基质细胞。根据培养过程中添加β-NMN和诱导蜕膜化情况分为实验组、对照组、空白组。实验组在子宫内膜基质细胞蜕膜化培养过程中添加β-NMN,对照组不添加β-NMN,无蜕膜化培养为空白组。比较3组细胞培养过程中蜕膜标志物泌乳素(PRL)和人胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)的mRNA表达和分泌水平。结果:实验组PRL(2.38±0.10 ng/nl)、IGFBP-1(1.89±0.12 ng/nl)水平均高于对照组(1.19±0.17 ng/nl、0.99±0.20 ng/nl)(P<0.05),对照组与空白组相比无差异;定量PCR检测蜕膜前后细胞内PRL(15.82±12.92)和IGFBP-1(9.86±8.67)的mRNA表达量上升(P<0.05)。结论:反复着床失败患者子宫内膜基质细胞蜕膜化中添加β-NMN能够提高蜕膜化水平。

代谢工程改造大肠杆菌发酵生产β-烟酰胺单核苷酸

为实现大肠杆菌高效生产β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN),设计模块化代谢改造策略。首先,对烟酰胺(nicotinamide,NAM)和β-NMN支路代谢涉及的8个酶进行失活,减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗。其次,通过引入NAM输入蛋白(BcNiaP)、β-NMN输出蛋白(BmPnuC)、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase,Prs)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt),敲除调节蛋白PurR,工程菌N12’摇瓶发酵可积累0.34 g/L的β-NMN;此后,比对筛选发现Comamonadaceae bacterium来源的Nampt活性较高且对底盘细胞负担较小;通过进一步强化BmPnuC和Prs的表达水平,工程菌N18摇瓶发酵β-NMN产量提高至1.36 g/L。最后,利用发酵罐分批补料发酵38 h,β-NMN产量达到10.2 g/L,NAM到β-NMN的摩尔转化率为74.5%。研究构建的β-NMN发酵菌株具有遗传背景清晰、无营养缺陷、无需诱导等优势,工业前景良好。

大肠杆菌合成烟酰胺单核苷酸途径构建及发酵工艺研究

β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)作为人体内重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的直接前体受到了广泛关注,目前工业上主要采用化学法或化学-酶催化法进行合成,发酵法仍未取得突破。为获得一株高产NMN的工程菌株,对大肠杆菌进行了代谢途径改造。首先在大肠杆菌中异源表达了来自松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)的烟酰胺磷酸核糖转移酶,构建了NMN的补救合成途径;为增强前体5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribose 1-pyrophosphate,PRPP)的供应,过表达了从葡萄糖出发的多个途径酶,促进了葡萄糖向磷酸戊糖途径的流动;同时,为有利于NMN积累,通过敲除NMN下游代谢分解途径基因pncC、ushA以及调控NAD+衍生物基因nadR,所获得的重组菌产量摇瓶水平达到60 mg/L,是初始产量的4.95倍;进一步在5 L罐上进行发酵试验,产量最高达到390.1 mg/L。该菌株用于NMN的发酵生产具有良好的潜力。

烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1对视网膜发育过程中中央碳代谢稳定性的作用

目的:探讨烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)在视网膜发育过程中对于中央碳代谢的作用。方法:构建NMNAT1条件性敲除小鼠及其同窝对照小鼠模型,使用PCR法进行基因型鉴定。在出生后第4天,取NMNAT1敲除小鼠和同窝对照小鼠的视网膜进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)靶向代谢组学检测和全转录组测序。代谢物提取物通过Shimadzu LC Nexera X2 UHPLC与QTRAP 5500 LC-MS/MS联用进行分析,并使用MultiQuant 3.0.3软件对提取的MRM峰进行积分。在NovaSeq6000平台上利用Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit进行全转录组测序,每个样本的总读数深度为100 M。使用FastQC验证读取质量,并使用BBTools包的Bbduk实用程序修剪引物。使用HISAT22.1.0进行读取比对,使用StringTie 1.3.6组装和量化转录本。使用DESeq2 R包鉴定差异表达的基因。结果:与对照小鼠相比,NMNAT1敲除小鼠视网膜中共有39种代谢物的含量发生了显著改变(P<0.05);通过代谢物集富集分析发现多种不同生化途径受到了不同程度的破坏,主要包括氨基酸代谢、糖酵解/糖异生、烟酸和烟酰胺代谢以及嘌呤代谢。其中,NMNAT1敲除组小鼠视网膜总NMNAT1水平和烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)水平降低约40%(P<0.05);烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和烟酸单核苷酸(NAM)的水平分别降低了约25%和55%(P<0.05);线粒体编码的NADH脱氢酶1(MT-ND1)的水平略有降低(P>0.05);上游糖酵解代谢物葡萄糖、葡萄糖6磷酸(G6P)和1,6-二磷酸果糖(F16bP)的水平大幅升高(P<0.05);磷酸二羟基丙酮(DHAP)和葡萄糖3磷酸(G3P)的水平大幅降低(P<0.05);a-KG和琥珀酸的水平降低了约30%(P<0.05);磷酸肌酸和肌酸的水平略有降低(P>0.5);赤藓糖醇(Erythritol)水平显著降低(P<0.05)。结论:NMNAT1缺失会导致视网膜中严重的特异性代谢缺陷,中央碳、嘌呤核苷酸和氨基酸代谢均受到损害,可能是导致严重视网膜变性的原因。

烟酰胺单核苷酸的合成、检测方法及其在动物生产中的应用

烟酰胺单核苷酸是生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的关键前体之一。NAD+是氧化还原的辅酶,广泛参与细胞内能量代谢、DNA修复、信号转导等多种生物学效应,对生物体细胞能量生成具有重要作用。烟酰胺单核苷酸的制备分为化学合成法和生物合成法,其中生物合成法包含微生物发酵法和酶催化法。烟酰胺单核苷酸的常用定性定量分析方法包括毛细管电泳法(CE)、液相色谱-紫外法(HPLC-UV)、核磁共振波谱法(NMR)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等。烟酰胺单核苷酸可以提高动物外周组织NAD+的生物合成,避免因NAD+水平下降导致动物机体生理生化过程的失能,从而改善代谢功能;还可以改善衰老卵母细胞的质量,提高胚胎发育能力,从而提高生殖功能。文章综述了烟酰胺单核苷酸的合成、检测方法及其在动物生产中的应用,以期为烟酰胺单核苷酸在动物生产中的应用研究提供参考。