人重组烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶2的表达、纯化及酶活力测定

目的:通过大肠杆菌体系诱导表达烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2),并测定纯化的重组NMNAT2酶蛋白催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的酶比活力。方法:在大肠杆菌BL21(DE3)体系优化条件下诱导表达NMNAT2重组蛋白,利用Ni-NTA Superflow Kit进行目的蛋白的纯化,Western blot法进行鉴定,并通过酶联荧光法测定其催化产物NAD,测定其酶活性。结果:人重组质粒NMNAT2-p ET-24a可以在大肠杆菌BL21(DE3)体系中诱导表达。诱导条件为:LB培养液(卡那霉素,15μg/m L)中37℃,IPTG(1.0 m M)诱导表达4 h。纯化获得的NMNAT2重组蛋白具有较高的酶活性。结论:NMNAT2-p ET-24a可在大肠杆菌BL21(DE3)体系中稳定表达,优化条件下可获得较高活性的纯化NMNAT2重组蛋白,可用于神经保护功能及酶蛋白的活性调控研究。

烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的表达、纯化及活性测定

目的获得具有较高纯度和酶活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶-1(Nmnat1),为进一步对其功能及调控的研究奠定基础。方法在大肠杆菌中进行Nmnat1表达的条件优化,采用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,并通过酶联荧光法测定酶活性。结果 BL21-CondonPlus (DE3)-RIL为适宜的宿主菌,优化的蛋白表达条件为:在2×YT培养基(37μg/ml氯霉素和75μg/ml卡那霉素)中于28℃、0.5mmol/LIPTG(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导8h。纯化获得的Nmnat1蛋白具有较高的纯度和酶活性。结论适宜的宿主菌对Nmnat1蛋白的高效表达至关重要,进行表达条件优化后可获得大量具有较高纯度和酶活性的目的蛋白。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对体外原代培养神经元轴突发育的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)1基因对体外原代培养小鼠神经元轴突发育的影响。方法在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元轴突形态。在所有的功能试验中,把一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂FK-866(CAS658084-64-1)用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓轴突生长,同时引起轴突分支的减少。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1对视网膜发育过程中中央碳代谢稳定性的作用

目的:探讨烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)在视网膜发育过程中对于中央碳代谢的作用。方法:构建NMNAT1条件性敲除小鼠及其同窝对照小鼠模型,使用PCR法进行基因型鉴定。在出生后第4天,取NMNAT1敲除小鼠和同窝对照小鼠的视网膜进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)靶向代谢组学检测和全转录组测序。代谢物提取物通过Shimadzu LC Nexera X2 UHPLC与QTRAP 5500 LC-MS/MS联用进行分析,并使用MultiQuant 3.0.3软件对提取的MRM峰进行积分。在NovaSeq6000平台上利用Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit进行全转录组测序,每个样本的总读数深度为100 M。使用FastQC验证读取质量,并使用BBTools包的Bbduk实用程序修剪引物。使用HISAT22.1.0进行读取比对,使用StringTie 1.3.6组装和量化转录本。使用DESeq2 R包鉴定差异表达的基因。结果:与对照小鼠相比,NMNAT1敲除小鼠视网膜中共有39种代谢物的含量发生了显著改变(P<0.05);通过代谢物集富集分析发现多种不同生化途径受到了不同程度的破坏,主要包括氨基酸代谢、糖酵解/糖异生、烟酸和烟酰胺代谢以及嘌呤代谢。其中,NMNAT1敲除组小鼠视网膜总NMNAT1水平和烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)水平降低约40%(P<0.05);烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和烟酸单核苷酸(NAM)的水平分别降低了约25%和55%(P<0.05);线粒体编码的NADH脱氢酶1(MT-ND1)的水平略有降低(P>0.05);上游糖酵解代谢物葡萄糖、葡萄糖6磷酸(G6P)和1,6-二磷酸果糖(F16bP)的水平大幅升高(P<0.05);磷酸二羟基丙酮(DHAP)和葡萄糖3磷酸(G3P)的水平大幅降低(P<0.05);a-KG和琥珀酸的水平降低了约30%(P<0.05);磷酸肌酸和肌酸的水平略有降低(P>0.5);赤藓糖醇(Erythritol)水平显著降低(P<0.05)。结论:NMNAT1缺失会导致视网膜中严重的特异性代谢缺陷,中央碳、嘌呤核苷酸和氨基酸代谢均受到损害,可能是导致严重视网膜变性的原因。

β-烟酰胺单核苷酸及其在维持基因组稳态中的研究进展

β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是辅酶Ⅰ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^(+))的前体,其主要通过NAD^(+)在细胞生命过程中发挥关键作用,包括DNA损伤修复信号通路、氧化还原反应和代谢反应等。补充NMN提高细胞内NAD^(+)水平以增强DNA损伤修复,已成为国内外研究的焦点。该文综述了NMN在延缓衰老、治疗疾病、维持基因组稳定性及细胞稳态方面的最新研究进展,分析了其提升宿主DNA损伤修复能力的作用机制,并对补充NMN的潜在风险进行探讨,为后续的NMN相关科学研究提供参考。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶1基因单核苷酸多态性与转移性结直肠癌化疗敏感性及预后的关系

目的探讨多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)基因单核苷酸多态性(SNP)与转移性结直肠癌患者化疗敏感性及生存预后的关系。方法选择195例初治转移性结直肠癌患者,均给予奥沙利铂联合卡培他滨方案化疗。首次化疗前抽取静脉血检测PARP1基因rs1136410位点T/C、 rs1805414位点T/C和rs8679位点T/C的基因型。2个化疗周期后评估疗效并统计化疗敏感率,随访记录生存情况。比较携带上述3个位点不同基因型的患者的化疗敏感率,并采用Logistic回归模型分析PARP1基因SNP与患者化疗敏感性的关系。比较携带上述3个位点不同基因型的患者的中位生存期,并采用Cox回归模型分析患者生存情况的影响因素。结果 (1) 195例转移性结直肠癌患者中完全缓解2例、部分缓解75例、疾病稳定58例、疾病进展60例,化疗敏感率为39.5%(77/195),不同临床特征的患者之间的化疗敏感率差异均无统计学意义(均P>0.05)。(2)PARP1基因rs1136410位点基因型与转移性结直肠癌患者的化疗敏感性有关,携带TC基因型或CC基因型的患者化疗敏感性高于携带TT基因型的患者(均P<0.05)。PARP1基因rs1805414、rs8679位点的SNP与转移性结直肠癌患者的化疗敏感性均无关(均P>0.05)。(3)携带PARP1基因rs1136410、 rs1805414位点不同基因型的患者的中位生存期差异均无统计学意义(均P>0.05)。携带PARP1基因rs8679位点变异基因型(TC+CC)的转移性结直肠癌患者中位生存期长于携带野生纯合基因型(TT)的患者(P<0.05)。Cox回归分析结果显示,PARP1基因rs8679位点SNP是转移性结直肠癌患者生存情况的独立影响因素(P<0.05)。结论 PARP1基因rs1136410位点SNP与转移性结直肠癌患者的化疗敏感性相关,相较于携带TT基因型的患者,携带TC或CC基因型的患者对奥沙利铂+卡培他滨的敏感性更高;而PARP1基因rs8679位点SNP可能影响转移性结直肠癌患者的生存预后,携带rs8679位点TC或CC基因型的患者的生存获益更佳。

烟酰胺-N-甲基转移酶在癌症发生发展中的作用研究进展

烟酰胺-N-甲基转移酶(nicotinamide N-methyltransferase, NNMT)利用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将烟酰胺转变为1-甲基烟酰胺。NNMT在肝脏组织、脂肪组织和某些癌组织中高表达,并在神经退行性疾病、肥胖和糖尿病患者的特定细胞中也呈现表达增加的趋势,因而国内外对NNMT的关注度上升。本文概述了NNMT在癌细胞迁移和侵袭、耐药性、凋亡、自噬等方面的作用,并对相关上下游的分子通路进行综述。

甲基转移酶样3通过调控MYC的N6-甲基腺苷水平促进急性髓系白血病细胞的增殖

目的探讨甲基转移酶样3(METTL3)在急性髓系白血病(AML)细胞增殖中的功能和调控机制。方法通过基因表达汇编数据集检索METTL3在AML患者中的表达情况及METTL3在成体造血干/祖细胞髓系分化中的表达情况;在MOLM13细胞中利用慢病毒转导的方式抑制METTL3的内源表达,检测细胞增殖情况,总mRNA的N6-甲基腺苷(m6A)水平,采用基因特异的m6A RNA免疫共沉淀检测MYC mRNA上的m6A水平,并进一步检测MYC mRNA和蛋白的表达水平。结果与正常对照相比,METTL3在AML-M5型患者中有上调趋势;幼稚细胞中的METTL3相对表达量显著高于成熟的单核细胞(t=4.504,P=0.0098)。抑制内源METTL3的表达后,MOLM13细胞增殖减缓(P<0.001),MOLM13细胞总mRNA的m6A水平降低(t=3.606,P=0.042),MYC上特异的m6A水平显著降低(P<0.01),MYC的表达显著减少(P<0.01)。结论 METTL3在MOLM13细胞中可通过增加MYC的表达水平而发挥原癌基因的功能。

微RNA-342-3p/末端尿苷酰转移酶1/凝血酶敏感素-2通路在胰腺导管腺癌中的作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-342-3p/末端尿苷酰转移酶1(TUT1)/凝血酶敏感素-2(THBS2)通路在胰腺导管腺癌中的作用及miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA表达与患者临床病理学参数的关系。方法选择2008年5月至2021年3月在遂宁市中心医院行根治性手术切除的胰腺导管腺癌标本(n=80)和对应癌旁正常组织标本(n=20)为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测胰腺导管腺癌组织和癌旁正常组织中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的表达。将对数生长期人胰腺导管腺癌细胞株PANC-1细胞分为对照组(转染miR-NC)、miR-342-3p过表达组(转染miR-342-3p mimic)、miR-342-3p抑制剂组(转染miR-342-3p inhibitor)、Vector组(转染pCS4-HA vectors)、TUT1组(转染pcDNA3-Flag-TUT1)、阴性对照组(转染sh-NC慢病毒载体)、TUT1沉默组(转染pGCshL-TUT1载体)、miR-342-3p过表达+TUT1组(同时转染miR-342-3p mimic和TUT1)、miR-342-3p过表达+THBS2组(同时转染miR-342-3p mimic和THBS2)、TUT1+THBS2组(同时转染pcDNA3-Flag-TUT1和THBS2)。采用细胞计数试剂盒-8检测10组细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测10组细胞的凋亡情况,采用双荧光素酶报告系统检测miR-342-3p与TUT1的靶向关系,采用Western blot法检测对照组、miR-342-3p过表达组和miR-342-3p抑制剂组PANC-1细胞中TUT1、THBS2蛋白的表达。结果胰腺导管腺癌组织中miR-342-3p TUT1、THBS2 mRNA的相对表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。不同年龄、不同肿瘤大小、淋巴结是否转移和不同肿瘤分期患者癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);高分化癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达显著高于中+低分化癌组织(P<0.05)。培养0 h时,各组PANC-1细胞的增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1组细胞的增殖能力均显著低于Vecort组,细胞的凋亡率显著高于Vecort组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1沉默组细胞的增殖能力显著高于阴性对照组,细胞凋亡率显著低于阴性对照组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,miR-342-3p抑制剂组的细胞增殖能力显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。培养24 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组与miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养48、72 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组的细胞增殖能力均显著低于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p抑制剂组细胞的凋亡率显著低于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组细胞的凋亡率显著高于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中野生型TUT1报告基因的荧光素酶活性显著高于对照组(P<0.05),突变型TUT1报告基因的荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p抑制剂组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论激活miR-342-3p/TUT1/THBS2通路可抑制PANC-1细胞增殖,促进其凋亡,进而抑制胰腺导管腺癌的发展,miR-342-3p/TUT1/THBS2通路有望成为诊治胰腺癌的潜在靶点。

m6A甲基转移酶METTL3通过β‐arrestin 1/p65调控结肠癌细胞增殖

目的探讨m6A甲基转移酶METTL3通过β-arrestin 1/p65在结肠癌细胞中的作用机制。方法使用结肠癌细胞系HCT116,应用荧光定量PCR、Western blot测定结肠癌细胞中METTL3、β-arrestin 1及增值蛋白PCNA、Cyclin D1及Cyclin E的表达水平;利用细胞转染及细胞克隆实验,观察METTL3、β-arres-tin1和p65在结肠癌细胞增殖中的作用。结果METTL3和β-arrestin 1在结肠癌细胞中表达升高(以actin作为内参基因,与正常对照组比较,P<0.05)。结肠癌细胞转染METTL3-shRNA后,转染组灰度(0.36±0.046)较对照组(1.27±0.14)明显减少(P=0.0004);与对照组克隆数(465±42)比较,转染组细胞增殖(85±37)明显减少(P<0.05);细胞增殖蛋白PCNA、Cyclin D1及Cyclin E的表达也明显减少(分别为P<0.01、0.05、0.01);结肠癌细胞中METTL3、β-arrestin 1和p-p65蛋白表达均增高(均为P<0.05)。随后HCT116细胞沉默MET-TL3的表达,发现细胞中β-arrestin 1、p-p65蛋白的表达明显下降(均为P<0.05)。结论METTL3影响结肠癌细胞的增殖可能通过β-arrestin 1/p65调控参与肿瘤的发生发展。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对慢性帕金森病小鼠模型黑质中酪氨酸羟化酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对慢性帕金森病(PD)小鼠模型(C57BL/6小鼠)黑质中酪氨酸羟化酶(TH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)表达的影响。方法利用重组慢病毒转染1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制备慢性PD小鼠模型。依据不同处理方式分为3组:对照组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射空白对照重组慢病毒(LV-GFP),1周后腹腔注射生理盐水];MPTP组(经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射LVGFP,1周后建立MPTP慢性PD模型);NMNAT1组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射NMNAT1基因的过表达重组慢病毒(LV-NMNAT1),1周后建立MPTP慢性PD模型]。采用Western blot法检测3组小鼠黑质中TH及caspase-3半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1组黑质中TH蛋白表达量较MPTP组高(t=7.985,P<0.001),caspase-3蛋白表达量较MPTP组低(t=8.901,P<0.001)。结论 NMNAT1能增加TH表达发挥一定的神经保护作用,并通过减少caspase-3表达水平参与抗细胞凋亡。

RNA甲基转移酶METTL3在急性髓系白血病发生发展及耐药中的研究进展

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是成人最常见的血液系统恶性肿瘤,其广泛的基因组变化和分子突变为药物的开发提供了潜在靶点。目前靶向治疗药物及免疫治疗无法替代传统的“3+7”方案。30%~40%的初治AML患者对于传统蒽环类方案原发耐药,治疗效果极差,是AML治疗及研究领域的重大难题。甲基转移酶样3(methyltransferaselike 3,METTL3)作为重要的甲基转移酶在调节AML发生发展及耐药中具有重要意义。本文总结了METTL3在AML发生发展及耐药中的作用及其在抗白血病治疗中的潜力,以期为克服AML的耐药及复发提供新思路及潜在治疗靶点。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对MES23.5帕金森病细胞模型过氧化氢酶及酪氨酸羟化酶蛋白表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对帕金森病(PD)细胞模型(MES 23.5细胞)过氧化氢酶(CAT)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法利用质粒转染或SiRNA技术分别处理MES 23.5细胞,依据不同处理方式分为6组:pEGFP组、pEGFP+MPP+组、NMNAT1-OE+MPP+组、pMagic4.1组、pMagic4.1+MPP+组和NMNAT1-RNAi+MPP+组。采用Western blot法检测各组MES23.5细胞的CAT和TH半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1-OE+MPP+组、pMagic4.1+MPP+组CAT表达量和TH蛋白表达量均升高;NMNAT1呈低表达的pEGFP+MPP+组、NMNAT1-RNAi+MPP+组CAT蛋白表达也有所降低,TH蛋白表达量下降。结论 NMNAT1通过增加CAT表达水平参与抗氧化应激,并且增加TH表达,具有一定的神经保护作用。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对多巴胺能细胞系帕金森病细胞模型的保护作用

帕金森病又称震颤麻痹，主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性死亡［1］，从而导致基底神经节功能紊乱。该病好发于中老年人，65岁以上人群帕金森病患病率为1％～2％［2］。轴索损伤和细胞凋亡是帕金森病患者重要的病理生理学特征。现在越来越多的研究表明轴索变性在神经退行性疾病中起着重要作用，一项通过对慢华勒变性（Wlds）基因变异小鼠进行的研究［3］结果提示，轴索损伤是一个主动过程，而其早于神经元细胞的凋亡［4］，这将有可能成为治疗帕金森病的一个重要突破口。 Wlds蛋白是一种嵌合蛋白，它由N-端泛素化因子E4 b在内的70个氨基酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD）合成酶烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1（ NMNAT1）的全部序列组成［5］，现已证明后者单独存在即可很大程度地延缓轴索损伤［6］，但目前针对帕金森病细胞模型是否有保护作用所进行的研究甚少，其具体机制也尚不明确。因此，我们利用质粒转染技术调节NMNAT1的表达，观察细胞轴索长度、超氧化物歧化酶1（ SOD1）及天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase3）表达的变化，探讨NMNAT1对帕金森病细胞模型的保护作用，从而为帕金森病的神经保护治疗提供理论依据。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对原代培养小鼠神经元活力的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶I（NMNATl）基因对原代培养小鼠神经元活力的影响。方法取原代培养神经元，分成正常对照组、过表达NMNATl慢病毒感染组、RNA干扰慢病毒感染组，后两组分别感染小鼠NMNATl基因的过表达和RNA干扰慢病毒颗粒以上调和下调NMMT1基因的表达水平。应用MTT染色观察各组原代培养小鼠神经元活力的变化。结果与正常对照组原代培养小鼠神经元活力比较，过表达NMNAT1慢病毒感染组神经元的细胞活力显著增强，而RNA干扰慢病毒感染组神经元的细胞活力受到严重干扰，差异有统计学意义（P=0．025．P=0．027）。结论NMNAT1基因在神经元发育过程中起重要作用，其缺失可能导致中枢神经系统的神经退化。

干扰烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1表达对帕金森病小鼠模型的作用及其机制研究

目的探讨干扰烟酰胺单核苷酸转移酶1（NMNAT1）基因表达在帕金森病小鼠模型中的作用及其机制。方法将C57BL/6种系小鼠30只按随机数字表法随机分为1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）组、干扰NMNAT1表达（siNMNAT1＋MPTP）组和对照组，每组10只。siNMNAT1＋MPTP组小鼠黑质注射由连接绿色荧光蛋白（GFP）的小干扰RNA（siRNA－GFP）构成的腺病毒，MPTP组及对照组注射等量GFP构成的腺病毒，然后siNMNAT1＋MPTP组与MPTP组小鼠腹腔注射MPTP来构建慢性帕金森病小鼠模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。评估小鼠的运动协调能力，采用免疫荧光染色法测定黑质多巴胺能神经元数目，采用RT－PCR评估纹状体酪氨酸羟化酶（TH）表达水平，采用Western印迹法检测黑质中TH、超氧化物歧化酶1（SOD1）、B淋巴细胞瘤－2（Bcl2）蛋白和Bcl2相关X（Bax）蛋白的表达。结果与对照组相比，siNMNAT1＋MPTP组、MPTP组的运动协调能力[滚轴实验滑落时间：siNMNAT1＋MPTP组（62.8±15.7）s，MPTP组（77.9±13.5）s，对照组（122.0±25.2）s]、多巴胺能神经元计数（siNMNAT1＋MPTP组45.0±6.7，MPTP组68.0±11.3，对照组93.0±12.8）及纹状体TH表达水平均降低且差异具有统计学意义（滚轴实验滑落时间：t＝－6.291, P＝0.000；t＝－4.865, P＝0.000。多巴胺能神经元计数：t＝－10.482，P＝0.000；t＝－4.624，P＝0.000。TH表达水平：t＝－9.117，P＝0.000；t＝－5.716，P＝0.000）。与MPTP组相比，siNMNAT1＋MPTP组小鼠的协调运动能力降低，但差异无统计学意义，而多巴胺能神经元计数及纹状体TH表达均明显减少（t＝－5.487，P＝0.000；t＝－5.146，P＝0.003），黑质中SOD1表达水平（t＝－4.143，P＝0.001）、Bcl2/Bax比值均明显降低（t＝－6.303，P＝0.000），Bax蛋白表达水平明显升高（t＝3.550，P＝0.002）。结论干扰帕金森病小鼠模型NMANT1表达可通过影响细胞凋亡、氧化应激促进多巴胺能神经元的丢失，降低小鼠的运动协调能力。

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的3-氨基-3-羧基丙基利用酶研究进展

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物体内重要的辅因子。SAM的结构中具有3个不稳定的C-S键,不同的SAM依赖酶能够选择性地切割其中不同的C-S键来催化各种类型的反应。其中,利用SAM甲基部分的甲基转移酶和腺苷部分的SAM自由基酶被广泛研究。UniProt数据库中保存了超过1800000条SAM依赖的甲基转移酶序列;SAM自由基酶也已经成为最大的酶家族之一,数目超过700000个。但利用SAM中3-氨基-3羧基丙基(3-amino-3-carboxypropyl,ACP)的酶却报道相对较少,本文对目前这一类酶的研究进行分类介绍,并对这一领域未来研究方向进行展望。

甲基化转移酶样蛋白3在急性心肌梗死患者外周血中的表达及对缺氧缺血所致心肌细胞损伤的调节作用

目的探讨甲基化转移酶样蛋白3(METTL3)在急性心肌梗死患者外周血中的表达及对急性缺氧/缺血(HI)所致心肌细胞损伤的调节作用。方法(1)收集60例急性心肌梗死患者和60例健康者的血浆和血清,采用酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量聚合酶链反应法分别检测血清和血浆中METTL3的表达水平。(2)取人心肌细胞AC16,分为对照组、HI-2h组、HI-4h组、siMETTL3+HI-2h组、siNC+HI-2h组;对照组不进行任何处理,HI-2h组、HI-4h组使用1%O 2和1%胎牛血清培养基诱导HI心肌细胞模型,siMETTL3+HI-2h组、siNC+HI-2h组分别转染有效沉默METTL3的小干扰RNA序列、阴性对照小干扰RNA序列后建立HI心肌细胞模型。检测各组AC16细胞的增殖率和凋亡率,METTL3、激活型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cleaved-Caspase3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)。将溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1添加至培养基后,按照上述方法进行分组及干预,检测微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)、人死骨片1(SQSTM1)的蛋白表达水平。结果(1)心肌梗死患者血浆METTL3 mRNA相对表达水平以及血清中METTL3表达水平均高于健康者(P<0.05)。(2)与对照组比较,HI-2h组、HI-4h组AC16细胞的增殖率降低,细胞凋亡率升高,METTL3蛋白、cleaved-Caspase3蛋白、Bax/Bcl-2比值、SQSTM1蛋白的表达上调,而LC3B-Ⅱ的蛋白表达下调(均P<0.05)。与HI-2h组和siNC+HI-2h组比较,siMETTL3+HI-2h组的细胞增殖率升高,细胞凋亡率降低,METTL3、cleaved-Caspase3、Bax/Bcl-2比值、SQSTM1的蛋白表达下调,LC3B-Ⅱ的蛋白表达上调(均P<0.05)。结论METTL3在心肌梗死患者体内和HI诱导的急性心肌细胞损伤模型中的表达均升高,沉默METTL3可以抑制HI心肌细胞的凋亡并增加自噬通量,从而促进细胞增殖的恢复。

m6A甲基转移酶METTL3通过AFF4/NF-κB/MYC信号网络影响膀胱癌的研究进展

膀胱癌(BCa)是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一,发病机制目前尚未明确。甲基转移酶3(METTL3)是N6-甲基腺苷甲基转移酶复合物(m6A MTC)的核心部分,介导mRNA的甲基化修饰,影响mRNA的稳定性和翻译过程。研究表明METTL3可以通过AFF4/NF-κB/MYC信号网络对BCa细胞分裂增殖起到促进作用。该信号网络涉及多种信号分子,METTL3可分别影响AFF4、NF-κB和MYC的表达水平影响其下游通路,促进肿瘤发展。

甲基转移酶3调控pri-miR-21甲基化修饰在糖尿病肾病肾脏纤维化中的作用

目的·探讨甲基转移酶3(methyltransferase like 3,METTL3)调控pri-miR-21的N^(6)-甲基腺苷(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)甲基化修饰在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠肾脏纤维化发病机制中的作用。方法·采用8周龄雄性db/db小鼠作为DN模型小鼠,db/m小鼠作为对照,同时按照是否经尾静脉注射S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂3-脱氮腺苷(3-deazaadenosine,DAA),共随机分为4组(5只/组),分别为db/m组、db/db组、db/m+DAA组和db/db+DAA组;8周龄开始注射DAA,注射1次/5 d,共注射8次。DAA干预结束后继续饲养小鼠至19周龄,收取各组小鼠血、尿、肾脏组织标本。检测血糖、血肌酐、尿白蛋白肌酐比(albumin-to-creatinine ratio,ACR),肾脏行苏木精-伊红(H-E)染色、Masson染色及天狼星红染色观察病理变化;试剂盒检测肾脏总RNA中m^(6)A的甲基化水平;Western blotting检测肾脏METTL3及纤维化相关蛋白表达;实时定量PCR检测肾脏总pri-miR-21和成熟miR-21;使用免疫磁珠富集肾脏组织中m^(6)A甲基化RNA,并通过PCR检测其中m^(6)A甲基化的pri-miR-21。结果·相较于db/m组,db/db组小鼠血糖,血肌酐,ACR,肾脏METTL3、m^(6)A甲基化修饰水平、纤维化相关蛋白、总pri-miR-21、m^(6)A甲基化pri-miR-21和成熟miR-21表达水平均显著增加(均P<0.05),小鼠肾脏系膜基质增多、肾小球基底膜增厚、胶原纤维累积显著增加。相较于db/db组,db/db+DAA组血糖,血肌酐,ACR,肾脏m^(6)A甲基化修饰水平、纤维化相关蛋白、m^(6)A甲基化pri-miR-21和成熟miR-21表达水平均显著下降(均P<0.05),总pri-miR-21表达水平显著升高(P=0.000),METTL3蛋白表达水平未见显著变化,小鼠肾脏损伤及纤维化程度显著减轻。结论·pri-miR-21的m^(6)A甲基化修饰促进miR-21成熟,进而促进DN小鼠肾脏纤维化的发生发展;抑制METTL3可通过调控pri-miR-21的m^(6)A甲基化修饰抑制DN小鼠肾脏纤维化。