人重组烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶2的表达、纯化及酶活力测定

目的:通过大肠杆菌体系诱导表达烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2),并测定纯化的重组NMNAT2酶蛋白催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的酶比活力。方法:在大肠杆菌BL21(DE3)体系优化条件下诱导表达NMNAT2重组蛋白,利用Ni-NTA Superflow Kit进行目的蛋白的纯化,Western blot法进行鉴定,并通过酶联荧光法测定其催化产物NAD,测定其酶活性。结果:人重组质粒NMNAT2-p ET-24a可以在大肠杆菌BL21(DE3)体系中诱导表达。诱导条件为:LB培养液(卡那霉素,15μg/m L)中37℃,IPTG(1.0 m M)诱导表达4 h。纯化获得的NMNAT2重组蛋白具有较高的酶活性。结论:NMNAT2-p ET-24a可在大肠杆菌BL21(DE3)体系中稳定表达,优化条件下可获得较高活性的纯化NMNAT2重组蛋白,可用于神经保护功能及酶蛋白的活性调控研究。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对体外原代培养神经元轴突发育的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)1基因对体外原代培养小鼠神经元轴突发育的影响。方法在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元轴突形态。在所有的功能试验中,把一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂FK-866(CAS658084-64-1)用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓轴突生长,同时引起轴突分支的减少。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对MES23.5帕金森病细胞模型过氧化氢酶及酪氨酸羟化酶蛋白表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对帕金森病(PD)细胞模型(MES 23.5细胞)过氧化氢酶(CAT)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法利用质粒转染或SiRNA技术分别处理MES 23.5细胞,依据不同处理方式分为6组:pEGFP组、pEGFP+MPP+组、NMNAT1-OE+MPP+组、pMagic4.1组、pMagic4.1+MPP+组和NMNAT1-RNAi+MPP+组。采用Western blot法检测各组MES23.5细胞的CAT和TH半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1-OE+MPP+组、pMagic4.1+MPP+组CAT表达量和TH蛋白表达量均升高;NMNAT1呈低表达的pEGFP+MPP+组、NMNAT1-RNAi+MPP+组CAT蛋白表达也有所降低,TH蛋白表达量下降。结论 NMNAT1通过增加CAT表达水平参与抗氧化应激,并且增加TH表达,具有一定的神经保护作用。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对慢性帕金森病小鼠模型黑质中酪氨酸羟化酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对慢性帕金森病(PD)小鼠模型(C57BL/6小鼠)黑质中酪氨酸羟化酶(TH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)表达的影响。方法利用重组慢病毒转染1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制备慢性PD小鼠模型。依据不同处理方式分为3组:对照组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射空白对照重组慢病毒(LV-GFP),1周后腹腔注射生理盐水];MPTP组(经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射LVGFP,1周后建立MPTP慢性PD模型);NMNAT1组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射NMNAT1基因的过表达重组慢病毒(LV-NMNAT1),1周后建立MPTP慢性PD模型]。采用Western blot法检测3组小鼠黑质中TH及caspase-3半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1组黑质中TH蛋白表达量较MPTP组高(t=7.985,P<0.001),caspase-3蛋白表达量较MPTP组低(t=8.901,P<0.001)。结论 NMNAT1能增加TH表达发挥一定的神经保护作用,并通过减少caspase-3表达水平参与抗细胞凋亡。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对原代培养小鼠神经元活力的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶I（NMNATl）基因对原代培养小鼠神经元活力的影响。方法取原代培养神经元，分成正常对照组、过表达NMNATl慢病毒感染组、RNA干扰慢病毒感染组，后两组分别感染小鼠NMNATl基因的过表达和RNA干扰慢病毒颗粒以上调和下调NMMT1基因的表达水平。应用MTT染色观察各组原代培养小鼠神经元活力的变化。结果与正常对照组原代培养小鼠神经元活力比较，过表达NMNAT1慢病毒感染组神经元的细胞活力显著增强，而RNA干扰慢病毒感染组神经元的细胞活力受到严重干扰，差异有统计学意义（P=0．025．P=0．027）。结论NMNAT1基因在神经元发育过程中起重要作用，其缺失可能导致中枢神经系统的神经退化。

结直肠癌组织中NMNAT2蛋白的表达及其临床意义

目的探讨结直肠癌组织中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)蛋白的表达及其临床意义。方法选择2015年1月至2017年12月收集的120例结直肠癌及癌旁组织标本为研究对象,给予常规固定-包埋-切片处理后,行免疫组化检测结直肠癌组织中NMNAT2蛋白,分析其表达情况及临床意义。结果 NMNAT2蛋白表达定位主要是结直肠癌细胞胞质,且结直肠癌组织NMNAT2蛋白表达阳性率高于癌旁正常结直肠组织(P<0.05)。不同性别、年龄、形态类型、组织类型、分化程度、肿瘤大小的结直肠癌组织NMNAT2蛋白表达情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同浸润深度、淋巴结转移、TNM分期的结直肠癌组织NMNAT2蛋白表达情况比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结直肠癌组织中NMNAT2蛋白特异性高,且直接参与结直肠肿瘤的发生、发展,可以作为结直肠癌的新促癌基因,成为临床新型结直肠癌诊断、治疗靶点。

NMNAT1对MES23.5帕金森病细胞模型Caspase8及TH蛋白表达影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对帕金森病(PD)细胞模型MES23.5细胞Caspase8、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达的影响。方法将MES23.5细胞分为6组,pEGFP组以NMNAT1高表达(NMNAT1-OE)空载质粒转染MES23.5细胞;pEGFP+MPP^+组以NMNAT1-OE空载质粒转染MES23.5细胞后,再向细胞内加入1-甲基-4-苯吡啶离子(MPP^+)100mmol/L;NMNAT1-OE+MPP^+组以NMNAT1-OE质粒转染MES23.5细胞,再向细胞内加入MPP^+100 mmol/L;pMagic4.1组以NMNAT1RNAi空载质粒转染MES23.5细胞;pMagic4.1+MPP^+组以NMNAT1 RNAi空载质粒转染MES23.5细胞,再加入100 mmol/L的MPP^+;NMNAT1-RNAi+MPP^+组以NMNAT1RNAi质粒转染细胞后,再加入100mmol/L的MPP^+。应用Western印迹分析方法检测各组TH、Caspase8蛋白表达。结果pEGFP+MPP^+组、pEGFP组、NMNAT1-OE+MPP^+组TH表达依次升高,Caspase8表达依次降低,3组间比较差异有显著性(F=18.46、13.26,P<0.05)。pMagic4.1组、pMagic4.1+MPP^+组、NMNAT1-RNAi+MPP^+组TH表达依次降低,差异有显著性(F=11.78,P<0.05);pMagic4.1+MPP^+组Caspase8表达最高,NMNAT1-RNAi+MPP^+组次之,pMagic4.1组最低,差异有显著意义(F=17.65,P<0.05)。结论 NMNAT1可能通过抑制Caspase8的表达、同时增加TH的表达而发挥神经保护作用。

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列。把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率。结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内。通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上。表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70%以上。结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具。

NMNAT1基因对体外原代培养神经元树突发育的影响

目的评价NMNAT1基因对原代培养小鼠神经元树突发育的影响。方法我们在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,我们上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元树突的形态。在所有的功能试验中,把FK-866(CAS658084-64-1)一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓树突生长和减少树突的数目。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

NMNAT2蛋白水平上调对细胞能量代谢影响的研究

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)上调造成神经元损伤的机制。方法HEK293T细胞过表达NMNAT2后,检测细胞糖酵解水平的改变,同时免疫印迹检测糖酵解限速酶和线粒体能量代谢相关蛋白表达水平的变化以及AMPK活性的改变。之后通过立体定位注射技术将腺相关病毒打入小鼠海马CA1区上调NMNAT2。免疫印迹检测在体过表达NMNAT2后上述细胞能量代谢相关蛋白的变化。结果HEK293T细胞过表达NMNAT2后,细胞外液的乳酸含量下降,6-磷酸果糖激酶-1和Sirt3的表达水平降低,AMPK活性增强。在体过表达NMNAT2后,Sirt3的表达水平降低,AMPK活性增强。结论 NMNAT2蛋白水平上调对细胞能量代谢的不利影响可能是造成神经元损伤的机制之一。

NMNAT1缺失对小鼠视网膜双极细胞和无长突细胞的影响

目的探索烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)缺失对视网膜神经元细胞结构及功能的损伤作用。方法利用NMNAT1^(fl/fl)小鼠与Six3启动子下表达Cre重组酶的转基因(Six3-Cre)小鼠杂交,获得NMNAT1条件基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠,实时荧光定量PCR和Western blot进行检测。在基因敲除小鼠出生后第0、4、10、30天(P0、P4、P10、P30)取材,制作冰冻切片,分别进行HE染色测量视网膜厚度,免疫荧光染色鉴定受损细胞类型以及检测恢复蛋白和视紫质表达水平。结果与同窝对照小鼠相比,基因敲除小鼠在P0时视网膜并没有明显的形态差异,视网膜厚度比较差异无统计学意义(P>0.05);到P4时基因敲除小鼠表现出视网膜内层和外层中的分层破坏和大规模细胞死亡,基因敲除小鼠P4时距视神经500μm、1000μm、1250μm的视网膜厚度均明显低于同窝对照小鼠(均为P<0.05),而距视神经1750μm的视网膜厚度尚未受影响(P>0.05);基因敲除小鼠P10时距视神经500μm、1000μm、1250μm、1750μm的视网膜厚度均低于同窝对照小鼠(均为P<0.05)。基因敲除小鼠全部视网膜内外层的退化在P30时几乎完成。此外,与同窝对照小鼠相比,P4时基因敲除小鼠视网膜神经节细胞、双极细胞和无长突细胞的数量差异均没有统计学意义(均为P>0.05),P10时视网膜神经节细胞没有显著差异(P>0.05),基因敲除小鼠双极细胞、无长突细胞分别减少了约75%、51%(均为P<0.05)。与同窝对照小鼠相比,基因敲除小鼠在P4时视网膜几乎不表达恢复蛋白和视紫质(均为P<0.05)。结论NMNAT1缺失主要导致视网膜双极细胞和无长突细胞损害以及恢复蛋白和视紫质缺失。

高通量筛选NMNAT1抑制剂及其肿瘤杀伤作用

目的利用在大肠杆菌体系中诱导表达的人源NMNAT1蛋白筛选其抑制剂,寻找治疗肿瘤的新药物。方法利用酶切连接体系将人源NMNAT1插入pET21b(+)载体,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达蛋白,对重组蛋白进行纯化,通过3段式酶联荧光法在2280种天然化合物中筛选具有抑制NMNAT1活性的化合物,并在细胞水平验证其对肿瘤细胞的杀伤效果。结果纯化得到较高纯度和活性的人重组NMNAT1蛋白;筛选出6种高效的NMNAT1抑制剂;其中一种抑制剂fraxetin能降低乳腺癌细胞NAD+含量,促进细胞凋亡,与敲低NMNAT1后转录组测序(RNA-seq)分析得出的细胞凋亡通路增强一致。结论Fraxetin是NMNAT1强效抑制剂,能够促进乳腺癌细胞凋亡。