超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其4种前体化合物含量

烟酰胺核糖体(NR)、烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酸(NA)和烟酰胺(NAM)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^(+))的4个前体化合物,口服后可在体内转化为NAD^(+)发挥抗衰老等功效。建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定茶叶中NAD^(+)及其4种前体化合物含量的方法,茶叶经水提取,稀释后直接进行UPLC-MS/MS分析。经方法学验证,5种目标化合物在各自范围内线性关系良好(R^(2)≥0.99),回收率为70.00%~120.00%,相对标准偏差为2.09%~14.50%,方法的定量限为0.10~0.50μg·L^(-1)。绿茶、红茶和黑茶中5种目标化合物的含量测定结果显示,绿茶和红茶是NR、NMN、NAD^(+)的良好天然食物来源;主成分分析结果显示,根据5种化合物含量能对红茶、绿茶、黑茶进行良好的类群区分;聚类分析结果显示,同一产地同一类型茶叶中5种化合物质量分布不均,离散度较高,无法进行区分。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-活性氧氧化应激信号通路在过敏反应中的作用及抗氧化剂干预实验研究

目的:探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Noxs)-活性氧(ROS)氧化应激通路在过敏反应中的作用,并考察抗氧化剂对过敏反应的影响。方法:体外建立肥大细胞脱颗粒模型,将细胞分为空白组、阳性对照组[培养基中含有Compound48/80 (C48/80) 100μmol/L]和抗氧化剂组[培养基中含有C48/80 100μmol/L+二苯基氯化碘盐(DPI) 5μmol/L]。利用酶联免疫吸附试剂盒检测各组细胞胞内β氨基己糖苷酶(β-Hex)、组胺、超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)及炎症介质白细胞介素-4(IL-4)和IL-6水平。利用荧光染色及流式细胞仪检测胞内活性氧(ROS)水平。采用Western blot检测三组细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1、2、3、4(Nox1、Nox2、Nox3、Nox4)蛋白表达情况。结果:C48/80诱导大鼠原代嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)释放β-Hex、组胺及炎症介质IL-4、IL-6,RBL-2H3细胞脱颗粒过程中胞内的SOD含量呈下降趋势,而LPO及ROS浓度升高。利用DPI处理脱颗粒的RBL-2H3细胞后,可以抑制胞内ROS水平,同时升高胞内SOD含量,降低LPO浓度,并且抑制了β-Hex、组胺、IL-4及IL-6的释放。当肥大细胞脱颗粒时,Nox1-4的蛋白表达均呈上升趋势,抗氧化剂DPI可以抑制这一反应。结论:阻断Noxs-ROS信号通路可以抑制过敏反应,抗氧化剂的应用为抗过敏提供了新的治疗思路。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在昼夜节律紊乱中的研究进展

昼夜节律紊乱在衰老、神经退行性病变、糖尿病和肿瘤的发生过程中起着重要的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^(+))的表达及合成NAD^(+)相关的关键酶具有明显的昼夜节律,昼夜节律受到NAD^(+)的调控,NAD^(+)表达减少可导致昼夜节律明显紊乱。补充NAD^(+)的前体物质或者促进NAD^(+)生成在缓解昼夜节律紊乱的同时可以明显缓解衰老、神经退行性病变、糖尿病和肿瘤的发生。

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中的烟酰胺单核苷酸α、β异构体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

目的建立固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)α、β异构体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)含量的方法。方法样品经5%甲醇水溶液超声提取,HLB固相萃取柱和混合型阴离子交换固相萃取柱分别净化,采用Waters ACQUITY UPLC?HSS T色谱柱进行分离,流动相为5 mmol/L乙酸铵含0.1%(V/V)甲酸水-甲醇,梯度洗脱;流速0.2 mL/min;柱温30℃;多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式定量分析,定量离子对NMN为m/z 335.0/123.0、NAD+为m/z 662.0/540.0。结果在最优条件下,α-NMN和β-NMN两种异构体的分离度为5.56。该方法中α-NMN、β-NMN和NAD+均在10~1000 ng/mL范围内线性良好,相关系数分别为0.9999,0.9998和0.9995。α-NMN、β-NMN和NAD+的检出限分别为4.0、2.0和1.0 ng/mL,定量限分别为10.0、5.0和3.0 ng/mL,回收率为93.8%~103.8%,相对标准偏差为2.1%~6.5%。结论该方法灵敏度高、选择性好、结果准确可靠,可同时快速检测各种基质食品中NMNα、β异构体和NAD+的含量。

核磁共振波谱法同时定量测定保健品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其前体化合物

目的 建立可同时测定保健品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)及其前体化合物含量的核磁共振波谱法。方法 采用核磁共振波谱技术,优化检测条件后,开发了标准曲线法和定量核磁共振法(quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)两种定量检测方法,用于测定保健品中两种形式的NAD及其4种前体化合物。结果 确定了各目标化合物的特征峰。对于标准曲线法,6种目标化合物的线性关系良好(r≥0.9999),除烟酰胺(nicotinamide,NAM)的定量限为0.5 mmol/L外,其他5种目标化合物的定量限均为0.2 mmol/L。考察了两种具有代表性的NAD+前体化合物的日间和日内重现性,烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)和NAM的日间重现性分别为0.21%和0.37%,日内重现性分别为1.03%和1.44%。用标准曲线法和qNMR两种方法分别对收集的10个NAD+补充剂保健品进行检测,误差合理(<5%)。结论 建立的核磁共振方法具有良好的可靠性和灵敏度,可用于保健品中NAD+及其前体化合物的生产控制和市场监管。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成及功能研究进展

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD^(+))是氧化还原反应的辅酶,生物体内的能量代谢、基因表达、细胞周期调控以及与年龄相关的疾病等生命过程都离不开NAD^(+)的参与。随着年龄增长,人体内NAD^(+)含量减少,从而引起一系列代谢综合紊乱的病理,因此外源补充NAD^(+)很有必要。本文综述了NAD^(+)的化学和生物合成途径以及动物实验和人体临床试验,旨在探究NAD^(+)的作用机制,为年龄相关疾病提供一种可行的治疗策略,以期为食品外源补充NAD^(+)提供新的研究基础。

基于计算机模拟探究鱼类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶源活性肽抗运动疲劳的功效

为了研究鱼类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Dehydrogenase,NADH Dehydrogenase)源活性肽抗运动疲劳的功效,该研究利用计算机模拟水解5种我国常见鱼类中的NADH Dehydrogenase蛋白亚基,将模拟水解得到的寡肽与乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)分别进行分子对接,确定与LDH和CK具有超高亲和力的寡肽(对接分数≤-160),并利用Pymol、Ligplot+软件分析寡肽与LDH和CK分子间相互作用机制。结果显示,5种鱼类的7种不同NADH Dehydrogenase蛋白亚基经计算机模拟水解和分子对接后共获得72个超高亲和力寡肽,其中,与LDH、CK均具有超高亲和力的寡肽共36种,对接分数最高且出现次数最多的寡肽是PTIW(-198.762、-204.400)。研究结果为提升鱼类蛋白质的高值化利用以及开发抗疲劳功能食品提供理论参考。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在卵母细胞成熟及受精激活中的作用

窦状卵泡的卵母细胞直径为100~130μm时已达成熟卵泡大小,此后的卵母细胞胞质及细胞核将经历生发泡期至第二次减数分裂中期过程中的重大变化,为随后的受精及将来的胚胎发育作准备。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)在传统上被视为参与包括线粒体中的电子传递在内的无数氧化还原反应的辅酶,在能量传递过程中发挥重要作用。在细胞信号传递方面,NADP可以作为底物合成烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP),进而诱发卵母细胞内钙活动。有关NADP自身在哺乳动物的卵母细胞成熟及受精激活中的影响及其作用机制目前知之甚少,也缺乏相关研究。本综述介绍NADP对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响,同时讨论了NADP对卵母细胞内相关钙波的作用。

小鼠卵母细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的荧光强度与其形态学关系

目的:探讨卵母细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)荧光强度与卵母细形态学的关系。方法:对小鼠实施控制性超促排卵得到体内发育的减数分裂II期(MII)卵母细胞82个。根据卵母细胞异常形态不同分为碎片组(n=8)、极体异常组(n=5),选择正常形态卵母细胞(n=9)作为对照组。通过双光子共聚焦显微镜测量观察卵母细胞内NADP荧光团分布,比较碎片组、极体异常组与正常形态组卵母细胞NADP荧光强度。结果:碎片组卵母细胞内NADP荧光强度高于正常形态组(225.04±7.23比189.50±30.66,P<0.05),而极体异常组卵母细胞与碎片组、正常形态组的NADP荧光强度相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:含有碎片的异常小鼠卵母细胞内NADP自发荧光增强,异常NADP荧光可反映线粒体状态异常,或可成为评价卵母细胞质量的一种手段。

ATR-FTIR研究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）在纳米氧化铝／水的界面作用

生物体内烟酰胺辅酶是电子载体，在各种酶促氧化．还原反应中起着重要的作用。依赖于辅酶I（NAD＋）和辅酶II（NADP＋）的脱氢酶至少催化6种不同类型的反应。此外，NAD＋也是DNA连接酶的辅酶，对DNA的复制有着重要的作用。因为辅酶是体内许多重要的不需氧脱氢酶的辅酶，其改变往往会影响代谢途径，它与多种酶蛋白构成全酶形式参与体内基础代谢。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)类似物的合成及性质

合成了3种新型结构稳定的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)类似物并通过~1H NMR、^(13)C NMR、^(31)P NMR和HRMS进行了表征。NAD^+类似物经80℃加热24 h后,通过~1H NMR确认其结构稳定;通过循环伏安法(CV)测定了其电化学性质,表明其仍然具有良好的氧化还原性能。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的聚亚甲基蓝／单壁碳纳米管修饰电极差分脉冲伏安法检测

研究了聚亚甲基蓝／单壁碳纳米管修饰电极的制备、电化学性质，采用差分脉冲伏安法成功应用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的测定。在实验条件下，该修饰电极对NADH氧化具有很好的电催化作用，NADH浓度在2．0～500μmol／L范围内与峰电流呈良好的线性关系，检出限为0．6μmol／L，结果令人满意。

1,2-萘醌修饰的碳纳米管对β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸电化学氧化的催化作用

将具有电活性的1,2-萘醌(1,2-naphthoqu inone,Nq)分子修饰到碳纳米管(CNT)表面形成Nq-CNT纳米复合体,用紫外可见(UV-V is)和红外光谱等方法对Nq-CNT进行了表征,结果表明Nq不仅能快速、有效地修饰到CNT表面,而且还能有效地改善CNT在水溶液中的分散性能。循环伏安结果显示,与GC电极相比,CNT能显著提高Nq的氧化还原峰电流,其伏安曲线上表现出一对几乎对称的氧化还原峰,式量电位E0′几乎不随扫速而变化。进一步的实验结果表明,Nq和CNT对β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的电化学氧化具有协同催化作用,与CNT或Nq相比,Nq-CNT具有较高的电催化活性,能使其氧化过电位降低超过510 mV。本研究对碳纳米管功能化方法具有简单、电极制作容易以及催化效率高等优点。

咖啡酸玻碳修饰电极对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的电催化氧化

研究了咖啡酸修饰电极的制备、性质及对NADH的电催化作用。修饰电极在 0 .1mol/LPBS缓冲溶液中 (pH 7.0 )于 0 .0～ +0 .5 0V(vs.Ag/AgCl )电位范围内呈现一对氧化还原峰 ,式量电位 (E0′)为 +0 .2 5 0V(vs.Ag/AgCl)。E0′随pH增加而朝负方向移动 ,pH在 5 .0～ 8.0范围内 ,其线性回归方程为E0′=0 .6 2 33-0 0 5 996pH ,R =0 .996 9。表观电极反应速率常数 (Ks)为 12 .3s-1。电极反应的电子数为 2且有 2个质子参与。该修饰电极对NADH的氧化具有很好的电催化作用。NADH浓度在 0 .1～ 6 .0mmol/L范围内与峰电流呈现良好的线性关系。

二化性家蚕滞育发动期间滞育性卵和非滞育性卵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变化

为了探究家蚕滞育发动期间呼吸耗氧量下降与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量变化的关系,用高效液相色谱法和分光光度法分别检测在25℃条件下产下后12～72 h的二化性家蚕滞育性卵与非滞育性卵中的还原型NAD(NADH)含量、氧化型NAD(NAD+)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性和胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)活性。滞育性卵中的NADH+NAD+含量、NADH/NAD+值及LDH活性分别在产下后18、36、24 h达到峰值,而cMDH活性处于波动中。在产下后24～72 h,非滞育性卵中的NADH/NAD+值极显著低于滞育性卵,而LDH和cMDH活性极显著高于滞育性卵。据此可以推测,滞育发动期间家蚕滞育性卵的NAD+降解增强和NAD+再生下降共同导致呼吸耗氧量下降。

早产大鼠高氧肺损伤组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶的动态表达及其意义

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1、2、5在早产大鼠高氧肺损伤组织中的动态表达及其意义。方法早产新生大鼠生后1d随机分为高氧和空气组,高氧组持续暴露于850mL/L氧气中,空气组置同一室内常压空气中。分别取二组大鼠高氧或空气暴露后1、4、7、10和14d肺组织标本,采用HE染色观察肺组织形态学改变,采用RT-PCR法在mRNA水平检测NADH脱氢酶亚单位1、2、5的表达。结果1.高氧暴露1、4d,早产大鼠肺组织形态较空气组无明显改变;高氧暴露7、10d,肺组织渐出现小血管充血扩张,肺泡腔内炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡数目减少、结构简单化和囊泡化等改变。2.空气组NADH脱氢酶亚单位1(ND1)和亚单位2(ND2)mRNA的表达随日龄增长渐降低,至7d时最低,随后其表达逐渐增高;空气组NADH脱氢酶亚单位5(ND5)mRNA的表达随日龄增长渐降低,至4d时最低,随后其表达逐渐增高。3.与同时间点空气组相比,高氧暴露后1、4和7dND1和ND5mRNA表达显著增强(Pa<0.05),随后其表达渐下降,10、14d时低于空气组,但二者相比差异无显著性意义(Pa>0.05);与同时间点空气组相比,高氧暴露后1、4d ND2 mRNA表达二组间差异无显著性意义(Pa>0.05),7d时较空气组极显著增强(P<0.01),10、14d时较空气组显著降低(Pa<0.05)。结论高氧可导致早产大鼠肺组织NADH脱氢酶表达改变,提示其可能参与高氧肺损伤的病理生理过程。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类CD38抑制剂的合成及生物活性评价

分别以1,3,5-三苯甲酰基-α-D-核糖、3,5-二苯甲酰基-2-脱氧-2,2-二氟戊呋喃糖-1-酮和D-木糖为原料,经由烟酰胺核苷及烟酰胺核苷酸中间体,合成了系列糖环经氟原子取代的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类CD38抑制剂.基于对CD38的水解抑制能力的考察,评价了所合成氟代NAD类似物的活性.结果表明,糖环上氟原子取代的数目和位置对抑制剂活性的影响十分明显,烟酰胺核苷的端基构型对活性的影响较大.2个化合物均显示出非常好的CD38抑制活性,其中化合物2a的抑制活性高出阳性对照物阿糖型氟代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2个数量级.

还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与人血清白蛋白相互作用的研究

运用荧光光谱、紫外光谱和计算机模拟分子对接等技术,研究了在模拟生理条件下还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)与人血清白蛋白(HSA)的作用方式及热力学特征。结果表明,NADH与人血清白蛋白的荧光猝灭机理属于静态猝灭;NADH与HSA在温度283K和310K时的结合常数和结合位点数分别为1.972×104 L.mol-1、0.9657和1.468×104 L.mol-1、0.9105,通过热力学计算得到反应的热力学参数;同步荧光光谱表明NADH使色氨酸残基的微环境亲水性增强;分子模型研究表明,二者通过疏水力、静电力和氢键共同作用结合。

家蚕烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(BmNADK)的高温应激表达分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD kinase,NADK)是生物体内氧化还原调节和氧化应激反应的重要酶类。以对高温耐受性不同的家蚕品种的5龄幼虫为材料,进行34℃连续高温处理和42℃高温冲击3 h处理,通过实时荧光定量PCR检测家蚕NADK基因(Bm NADK)在雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个器官组织中的表达水平,探究该基因是否与家蚕对高温的应激反应有关。结果显示,5龄期2种高温环境胁迫均可引起Bm NADK基因在蚕体3个器官组织中上调表达,其中在脂肪体表达的上调最为显著,且雄蚕脂肪体中的上调表达明显高于雌蚕,当恢复常温环境条件时,Bm NADK基因在蚕体组织的表达量也随之下降;高温胁迫下Bm NADK基因在耐高温家蚕品种7532幼虫组织中的表达量高于对高温耐受性差的品种皓月。研究结果显示Bm NADK基因与家蚕对高温的应激反应相关,在耐高温家蚕品种及雄蚕体内的应激表达水平相对较高。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在纳米α-氧化铝上的吸附作用

用紫外-可见吸收光谱、X射线衍射、荧光光谱和衰减全反射傅里叶变换红外(ATR-FTIR)光谱等方法,研究了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在纳米α-Al2O3粒子上的吸附行为。实验结果显示,NAD+的吸附量受pH值和离子强度影响较大,说明NAD+主要通过静电作用吸附在纳米α-Al2O3粒子上。采用ATR-FTIR光谱分析了不同pH值溶液中及被吸附的NAD+,发现吸附后的NAD+与溶液中NAD+的ATR-FTIR光谱相似,但磷酸根的吸收峰向高波数位移,说明磷酸根参与了表面静电作用。吸附过程符合Langmuir和Freundlich等温式。荧光实验结果显示,随着吸附剂α-Al2O3用量的变化,NAD+构象也发生变化。