SREBP-1/小凹蛋白1介导烟酸姜黄素酯对ApoE^(-/-)小鼠的抗动脉粥样硬化作用

目的探寻烟酸姜黄素酯对动脉粥样硬化病变的作用及机制。方法 50只7周龄Apo E-/-小鼠,随机分为五组,即对照组、高脂组、辛伐他汀组[5 mg/(kg·d)]、烟酸姜黄素酯低剂量组[33 mg/(kg·d)]和烟酸姜黄素酯高剂量组(99 mg/(kg·d)],其中对照组给予普通饲料,其他组给予高脂饲料喂养。连续干预6周之后处死动物,检测血清中血脂水平;油红O染色法和HE染色法观察小鼠主动脉斑块及肝脏脂质蓄积;ELISA法检测血清中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;Western blot法检测小鼠肝脏中小凹蛋白1和SREBP-1的表达。结果与对照组相比,高脂组血清中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)降低,主动脉粥样硬化斑块增多。与高脂组相比,烟酸姜黄素酯组小鼠血清中的TC和LDLC明显降低,TNF-α和IL-6水平下降,而主动脉粥样硬化斑块减轻,肝脏脂质减少;烟酸姜黄素酯组肝脏小凹蛋白1蛋白表达高于高脂组,而SPEBP-1蛋白表达低于高脂组。结论烟酸姜黄素酯预防性给药能抑制高脂喂养所致的Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成;机制可能与减少SREBP-1、增加小凹蛋白1蛋白水平,调节肝脏脂质代谢及炎症反应有关。

双烟酸姜黄素酯平衡溶解度及表观油水分配系数的测定

目的:测定双烟酸姜黄素酯平衡溶解度和油水分配系数,为研究新剂型提供基础。方法:将双烟酸姜黄素酯分别溶解于pH1.2~7.8的缓冲溶液介质中,利用HPLC法定量分析,以饱和法测定双烟酸姜黄素酯的平衡溶解度,以摇瓶法测定正辛醇-水及缓冲盐溶液中双烟酸姜黄素酯的表观油水分配系数。结果:双烟酸姜黄素酯在pH6.8时的溶解度最大,双烟酸姜黄素酯的油水分配系数在pH1.2,pH5.8,pH6.5,pH7.8中lgP_(ap)值落在有利于体内药物的吸收范围(lgP_(ap)值为1.69~1.98)。但在其pH2.0,5.0,6.8时lgP_(ap)值大于2,亲脂性较强。结论:双烟酸姜黄素酯的平衡溶解度和表观油水分配系数与缓冲溶液介质的pH有关。在溶解度相对较大的pH下脂溶性较强,难以被人体吸收,需要进一步做剂型研究。

应用Discovery Studio软件预测烟酸姜黄素酯抗动脉粥样硬化的作用靶点

目的运用计算机虚拟筛选技术预测烟酸姜黄素酯抗动脉粥样硬化作用的靶标蛋白。方法查阅与动脉粥样硬化相关靶标的文献,筛选出60余种与动脉粥样硬化相关的蛋白(分子对接的受体),再对蛋白质晶体结构数据库PDB中的目标蛋白的三维结构活性部位进行分析,采用北京创腾科技有限公司的Discovery Studio分子模拟软件包(版本3.0)中的LibDock模块将烟酸姜黄素酯(配体)与受体蛋白进行分子对接。结果以对接得出的配体在受体结合位点处的结合形式(poses≥80)和对接吻合度参数(LibDockscore≥100)作为阈值,筛选出CRP、MMP13、ACAT、CETP等11种受体蛋白与烟酸姜黄素酯存在较强的相互作用。结论该研究结果可预测烟酸姜黄素酯抗动脉粥样硬化的可能作用靶点,对该药的抗动脉粥样硬化药效学研究有一定的指导意义。

薄膜分散-超声法工艺参数对烟酸姜黄素酯纳米粒粒径及包封率的影响

目的:探索薄膜分散-超声法制备烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒的工艺参数对其粒径及包封率的影响,以期获得制备粒径小、包封率高的工艺参数。方法:采用HPLC法测定烟酸姜黄素酯的含量,以烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒粒径及包封率为评价指标,通过正交设计试验法、95%可信区间重叠法统计分析,优选薄膜分散-超声法制备烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒粒径小、包封率高的工艺参数。结果:烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒的最佳工艺参数为:水浴温度40℃,茄型瓶旋转速度80 r·min-1。制得的固体脂质纳米粒平均粒径为107.8 nm,聚合物分散性指数(PDI)为0.583,包封率为68.91%。结论:茄型瓶旋转速度对薄膜分散-超声法制备烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒的粒径影响较大,而水浴温度对其包封率影响较大,两者兼顾考虑,在优选的工艺条件下,可获得平均粒径较小、包封率较高的烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒。

SREBP—Caveolin-1信号通路介导的烟酸姜黄素酯抗动脉粥样硬化研究

Caveolin．1是分子量为21～24kDa的多功能信号蛋白，富集于细胞膜特异结构小凹、内质网和高尔基体等，并可在内质网与细胞膜之间穿梭。分子中含有胆固醇结合位点、NOS和TLR-4结合位点等。Caveolin—l参与多种信号通路调节；同时，与CyclophilinA（Annexin．11）、Cyclophilin40及HsP56组成胆固醇转运复合体，并通过与ABCA!或sR—B1耦联参与细胞胆固醇的跨膜转运，其活性受SREBP一1的调节。我们发现其介导姜黄素的抗动脉粥样硬化作用。烟酸姜黄素酯（curcuminnicotinate，CurNic）是本课题组根据药物化学拼合原理，将具有强大升高HDL功能的烟酸基团引入具有降脂兼抗炎抗免疫作用的姜黄素类化合物中，而形成的新型调脂抗炎化合物。采用分子模拟技术发现，CurNic与胆固醇转运相关蛋白质Caveolin一1、SREBP、ABCAl、TLR-4及炎症因子NF—KB等都具有较高的对接（dock）效果，其LibDock值分别为134、181、121、117和159。我们采用ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化模型初步研究表明，该化合物具有较强的升高HDL水平的作用，可显著升高HDLC水平，超过单用烟酸的水平，并抑制粥样斑块形成。同时降低血浆LDLC、TC水平，对TG也有一定降低作用，其效能与洛伐他汀相当。此外，CurNic还能明显降低血清CRP、IL-6、IL．10的含量，其效能与洛伐他汀相仿。在细胞实验中发现，CurNic上调Caveolin一1表达，抑制SREBPl剪切活化。小结：烟酸姜黄素酯可通过SREBP．Caveolin．1信号通路发挥抗动脉粥样硬化作用。

HPLC法测定烟酸姜黄素酯及其纳米粒的含量

目的:建立HPLC法测定烟酸姜黄素酯原料及其纳米粒中烟酸姜黄素酯的含量并进行方法学考察,为制剂工艺研究提供依据。方法:采用C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.5%醋酸溶液(65∶35)、流速:1.0 ml·min^(-1);检测波长:280 nm;柱温:30℃。结果:烟酸姜黄素酯在5.200~104.000μg·ml^(-1)范围内线性关系良好,r=0.999 4。烟酸姜黄素酯纳米粒及原料平均回收率分别为100.1%,100.9%,RSD分别为1.260%,0.995 0%(n=6)。结论:该分析方法简单,准确,重复性好,可用于烟酸姜黄素酯纳米粒及原料中烟酸姜黄素酯的含量测定及制备工艺研究。

烟酸姜黄素酯抑制LPS诱导的HUVECs分泌炎性细胞因子与内质网应激

目的探讨烟酸姜黄素酯(NC)对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌细胞因子的影响及其作用机制。方法体外培养HUVECs,用不同浓度NC孵育HUVECs 24 h。Western blot检测AMPK的磷酸化;用siRNA沉默磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)表达后,观察其对脂多糖(LPS)诱导NF-κB p65磷酸化、黏附分子表达、细胞培养上清中TNF-α和MCP-1分泌,以及内质网应激标志分子IRE-1、eIF2α和CHOP表达水平的影响。结果10~20μmol/L NC处理HUVECs 24 h后,AMPK的磷酸化水平显著增高(P<0.05),同时p65磷酸化有所减轻。沉默AMPK后,NC对NF-κB的抑制效应明显减弱(P<0.05)。同时,NC处理后,LPS所致ICAM-1,VCAM-1和E选择素等黏附分子表达明显降低(P<0.05),单核巨噬细胞THP-1与HUVECs的黏附作用也明显减轻,培养上清中TNF-α和MCP-1明显减少(P<0.05)。siRNA沉默AMPK后,上述效应有所减弱(P<0.05)。NC处理后可下调LPS所致的内质网应激标志分子IRE-1、eIF2α和CHOP的表达水平。而干扰AMPK表达后,可明显削弱NC对这些分子的抑制效应(P<0.05)。结论NC可抑制LPS诱导HUVECs表达和分泌黏附分子及细胞因子,并在一定程度上抑制内质网应激,其机制可能与激活AMPK有关。

烟酸姜黄素酯对低剪切应力诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及相关机制

目的:探讨烟酸姜黄素酯(curcumin nicotinate,CN)对低剪切应力(low shear stress,LSS)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡的影响及机制研究。方法:运用平行平板流动腔建立LSS诱导的HUVECs凋亡模型。采用Hoechst33258荧光染色,流式细胞术检测CN对LSS诱导的HUVECs凋亡的影响。Western blot检测CN对LSS诱导的HUVECs中前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)蛋白表达的影响。结果:Hoechst33258荧光染色结果显示,与静态培养组比较,LSS组(3 dyne/cm2,12 h)内呈现凋亡状态的HUVECs明显增多。与LSS组比较,各CN+LSS组内呈现凋亡状态的HUVECs明显减少,并且呈现浓度依赖性。其中以20μmol/L CN+LSS组凋亡细胞数最少;流式细胞术结果显示,与静态培养组比较,LSS组HUVECs凋亡率明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与LSS组比较,各CN+LSS组HUVECs凋亡率明显减少,并且呈现浓度依赖性,其中以20μmol/L CN+LSS组HUVECs凋亡率减少最为明显,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示与静态培养组比较,LSS组内PCSK9蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与LSS组比较,CN+LSS组内PCSK9蛋白表达下降,并且呈现浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中以20μmol/L CN+LSS组PCSK9蛋白表达下降最为明显(P<0.01)。结论:CN能够抑制LSS诱导的HUVECs凋亡,其作用机制与CN下调LSS处理的HUVECs中PCSK9蛋白表达相关。

烟酸姜黄素酯促进血管平滑肌细胞向收缩型转化

目的研究烟酸姜黄素酯(CurTn)调节血管收缩性的机制及其对血管平滑肌细胞(VSMC)表型调节的影响。方法将C57BL/6小鼠用50 mg/(kg·d) CurTn灌胃,连续给药6周后取小鼠胸主动脉,用Myography肌动描记仪记录血管收缩力,并检测血管组织中收缩蛋白的水平。将VSMC用10μmol/L CurTn孵育24 h,Western blot检测VSMC表型相关因子的表达;噻唑蓝法和划痕试验分别观察VSMC的增殖、迁移情况;油红O染色和高效液相色谱分析VSMC对低密度脂蛋白(LDL)的吞噬能力。结果 CurTn灌胃处理的小鼠胸主动脉血管的收缩力增强,且血管平滑肌组织中收缩蛋白的表达增加。CurTn增加VSMC中Myocardin及收缩型特异标志蛋白α-actin和SM22α的表达,同时下调增殖型特异标志物骨桥蛋白的水平。此外,CurTn阻止了VSMC的增殖、迁移及对LDL的吞噬作用。结论 CurTn能增强血管收缩力,其机制可能是通过促进VSMC的收缩表型而阻止其增殖表型来实现的。

双烟酸姜黄素酯纳米粒与双烟酸姜黄素酯体内转运动力学特性研究

目的提高双烟酸姜黄素酯的生物利用度,考察双烟酸姜黄素酯是否代谢为姜黄素。方法以新西兰家兔为试验对象,采用口服给予双烟酸姜黄素酯纳米粒与双烟酸姜黄素酯原料药后,在不同时间点采血,HPLC测定血中双烟酸姜黄素酯、姜黄素等成分含量,计算体内药物转运动力学参数AUC,比较两者的差别。结果采用统计矩法中的零阶矩法计算AUC,原料药的AUC平均值为(354.835±8.660)μg·L^(-1)·h,而纳米粒的AUC平均值为(883.335±16.37)μg·L^(-1)·h。纳米粒的AUC是原料药AUC的2.486倍。可知纳米粒与原料药相比显著提高了生物利用度;血中未检测到姜黄素。结论双烟酸姜黄素酯制成纳米粒可显著提高双烟酸姜黄素酯的生物利用度;双烟酸姜黄素酯在体内没有代谢为姜黄素。

薄膜-超声法制备双烟酸姜黄素酯纳米粒的辅料配比研究

目的优选薄膜-超声法制备双烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒的辅料配比。方法采用HPLC测定双烟酸姜黄素酯的含量,以双烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒的包封率为评价指标,通过三因素三水平Box-Bebnken响应面设计试验法筛选纳米粒辅料中硬脂酸、卵磷脂的用量及聚山梨酯-80的浓度,并确定最优处方辅料配比。结果最佳处方辅料配比为硬脂酸80 mg,卵磷脂150 mg,聚山梨酯-80(0.6%)20 m L,所得烟酸姜黄素固体脂质纳米粒包封率达65%,平均粒径为190 nm。结论用星点设计试验优化后制剂处方的双烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒最优处方辅料配比适合于制备双烟酸姜黄素酯固体脂质纳米粒。

姜黄素烟酸酯对血管平滑肌细胞增殖及ERK1/2信号通路的影响

目的探讨姜黄素烟酸酯(curcumin trinicotinate,Cur Tn)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖的影响及其可能机制。方法体外培养VSMC,体积分数为0.1的FBS刺激VSMC生长。MTT法观察CurT n对VSMC活力的影响;流式细胞术分析细胞周期;Western blot检测PCNA、p-ERK1/2、CyclinD 1蛋白的表达。结果 CurT n抑制VSMC增殖并呈现一定量效、时效关系,并且使G1期的细胞比例增加,S期细胞比例下降,PCNA蛋白表达下调。同时发现CurT n能明显抑制p-ERK1/2、CyclinD 1蛋白表达。结论 CurT n能明显抑制VSMC增殖,其作用机制可能与p-ERK1/2、CyclinD 1蛋白表达下调有关。

姜黄素烟酸酯的合成

以烟酸和姜黄素为原料,采用酰氯法经过二步反应合成了姜黄素烟酸酯,经红外光谱、核磁共振氢谱及质谱确证了该目标化合物的化学结构。考察了原料配比、反应温度、反应液pH值三个因素对反应产率的影响,优选出最佳合成工艺。最佳合成工艺为:n(姜黄素)∶n(烟酰氯盐酸盐)=1∶4(摩尔比)、反应温度25～30℃、反应液pH值为7～8。姜黄素烟酸酯收率达62%。

PCSK9/LDLR通路介导姜黄素烟酸酯促进HepG2摄取脂质

为研究PCSK9/LDLR通路介导姜黄素烟酸酯(CurTn)降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),减少动脉内膜下脂质沉积的分子机制,用5、10、15μmo/L姜黄素烟酸酯与25 mg/L LDL共孵育Hep G2细胞24 h,分别采用油红O染色、胆固醇荧光定量试剂盒、Di I-LDL摄取检测细胞内胆固醇含量及LDL摄取情况,用逆转录定量聚合酶链反应(RT-Q-PCR)检测LDLR及SREBP2的m RNA表达,蛋白质印迹检测LDLR、SREBP2及PCSK9蛋白表达.随姜黄素烟酸酯作用浓度的增高细胞内脂滴显著增多,细胞内游离胆固醇(FC)、总胆固醇(TC)含量增高,细胞内胆固醇摄取增多;RT-Q-PCR和蛋白质印迹检测发现,与对照组(Control)比较,5、10、15μmo/L姜黄素烟酸酯处理组LDLR蛋白表达增高,SREBP2 mRNA表达水平升高,PCSK9蛋白表达降低,但对LDLR mRNA及SREBP2蛋白表达无影响.结果表明:姜黄素烟酸酯通过降低PCSK9、减少LDLR降解、升高LDLR蛋白表达,促进HepG2细胞胆摄取胆固醇.初步说明CurTn可能通过抑制PCSK9介导LDLR溶酶体降解,促进肝脏清除血浆LDL-C水平.

姜黄素酯衍生物抗动脉粥样硬化作用靶点预测

目的运用计算机虚拟筛选技术预测姜黄素酯衍生物（烟酸姜黄素酯、烟酸阿司匹林姜黄素酯）抗动脉粥样硬化（atherosclero—sis，As）作用的靶标蛋白。方法查阅与动脉粥样硬化相关靶标的文献，筛选出60余种与As相关的蛋白（分子对接的受体），再对蛋白质晶体结构数据库PDB中的目标蛋白的三维结构活性部位进行分析，采用北京创腾科技有限公司的DiscoveryStudi—O分子模拟软件包（版本3．0）中的LibDock模块将姜黄素酯衍生物（配体）与受体蛋白进行分子对接。

姜黄素烟酸酯对辐射诱导的巨噬细胞IL-1β、IL-18表达的影响

目的研究姜黄素烟酸酯对巨噬细胞受射线照射产生的炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)的影响。方法将巨噬细胞分为空白对照组、单纯照射组及不同浓度姜黄素烟酸酯组(1.0、3.0和9.0μmol/L),应用Western blotting检测IL-1β、IL-18的表达。结果1.0、3.0和9.0μmol/L的姜黄素烟酸酯组与单纯照射组比较,差异有统计学意义(P<0.05),各浓度姜黄素烟酸酯组IL-1β、IL-18的蛋白表达量较单纯照射组下降;单纯照射组IL-1β、IL-18的蛋白表达量较对照组升高(P<0.05)。结论姜黄素烟酸酯可抑制辐射诱导巨噬细内炎症因子IL-1β、IL-18的产生。

姜黄素烟酸酯的绿色合成

目的:考察姜黄素烟酸酯的合成及表征,优化其合成工艺路线,为产业化奠定基础。方法:以姜黄素和烟酸为原料,N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)为脱水剂和4-二甲胺基吡啶(DMAP)为催化剂,在室温下合成姜黄素烟酸酯。结果:目标物的化学结构经红外光谱(IR)、液相色谱质谱联用(LC/MS)、氢核磁共振(1H-NMR)表征,本法合成姜黄素烟酸酯的收率达89.4%。结论:改进后的合成工艺操作简便、反应条件温和,重现性好,收率较高,易于放大制备。

姜黄素衍生物的合成及抑菌活性研究

以含有杂原子的生物素、硫辛酸、异烟酸和姜黄素为原料,以二步酰氯法合成了姜黄素生物素酯、姜黄素硫辛酸酯、姜黄素异烟酸酯。经红外,核磁共振氢谱和质谱确证了化合物的结构。在相同条件下,以姜黄素为对照测定了产物对金色葡萄球菌的抑菌性能。结果显示,姜黄素硫辛酸酯、姜黄素生物素酯、姜黄素异烟酸酯三种姜黄素衍生物在抑菌活性上均有不同程度的增强,最小抑菌浓度(MIC)分别为2.5、5.0、5.0 mg/mL,在最小抑菌浓度下抑菌圈分别为10、10、8 mm。