食品中热损伤沙门氏菌选择性增菌及实时荧光聚合酶链式反应检测

为了能够高效检测食品中的亚致死损伤沙门氏菌,首先采用热激胁迫的方法得到亚致死损伤沙门氏菌细胞,进而基于选择性增菌培养液SEL建立一种实时荧光聚合酶链式反应检测技术。结果表明:在SEL中经过20h增菌培养后,无论是否经过修复培养,1～2CFU/5mL SEL的亚致死损伤细胞都能得到完全修复并增菌至109CFU/mL水平;依此建立的实时荧光聚合酶链式反应检测技术的纯菌扩增效率为95.41%,检测限为4CFU/反应体系,在人工污染碎食品样品中的检测限为3CFU/10g碎牛肉,而且与传统培养检测方法的结果相吻合。本方法在24h内即可完成食品中热损伤沙门氏菌的修复、选择性增菌以及实时荧光聚合酶链式反应检测,可应用于食品中沙门氏菌污染状况调查及高效检测。

聚合酶链式反应(PCR)量热学的实验研究

聚合酶链式反应(PCR)是一种人工体外扩增特异DNA片段的技术。PCR反应的三个过程都是热过程。本文首次利用差式扫描量热仪(DSC)模拟PCR反应。试验表明PCR反应变性过程是吸热过程;退火和延伸过程是放热过程;并且获得了这些过程的量热学数据。这些研究结果对分析和判断PCR临床检验的假阴性是有用的。

连续流动式聚合酶链式反应芯片的设计进展

介绍了PCR的概念以及微型PCR芯片的优点,着重介绍连续流动式PCR(continuousflowPCR)芯片/微装置的一般原理、串行流动及其设计进展。

一种恒温区切换的快速PCR热循环系统设计

概述PCR(Polymerase Chain Reaction),即聚合酶链式反应,是一种分子生物学技术,主要用于在体外大量扩增特定DNA片段。PCR仪器是利用PCR技术对特定DNA扩增的一种仪器设备,PCR技术的一个重要特点是其灵敏度高、特异性好。这意味着即使在样本中存在少量的病原体,也能被检测到,从而提高了诊断的准确性。传统PCR设备适用于需要进行大量DNA扩增和高通量检测的场合,但其反应过程相对复杂,检测耗时长,且可能存在污染风险。

快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的 pTaq表达质粒转化E .coliDH5α菌株 ,IPTG诱导表达TaqDNA聚合酶 .利用该酶的热稳定性 ,经两轮 - 70℃深度冷冻和 75℃水浴 ,细菌裂解释放内容物 ,以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化TaqDNA聚合酶的目的 .PCR扩增反应表明所制备的TaqDNA聚合酶的活力、敏感性、特异性均达到试验要求 .该方法具有快速简便的优点 .

DNA聚合酶基因pfu的克隆及初步表达

通过分子克隆技术从嗜热极端微生物Pyrococcusfuriosus中克隆出高热稳定性的 pfuDNA聚合酶基因 ,琼脂糖凝胶电泳显示基因片段的长度为 2 .3kb ,将其转化入大肠杆菌中并获得初步表达 .重组酶成功地扩增了 80 0bp的DNA片段 .

Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变文库热稳定性提高突变体的筛选及鉴定

利用易错聚合酶链式反应技术引入随机诱变,构建一个Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变体库。经过筛选,获得一个芳香基硫酸酯酶热稳定性提高的突变株4-153。序列分析表明,该突变体有2个氨基酸替换,包括D84A和H260L。以对硝基苯硫酸钾为底物,突变酶4-153(M4-153)的最适反应温度为55℃,在45、50、55、60℃处理30 min后,M4-153分别保留85%、83%、48%和13%的残留酶活力。野生型酶(WT)在45、50、55、60℃处理30 min后,分别保留79%、68%、21%和1%的残留酶活力。M4-153与WT相比具有更好的热稳定性。M4-153的最适反应pH值为8.0,在pH 5.0~9.0范围内保持稳定。EDTA对突变酶的抑制作用表明,金属离子在突变酶的催化过程中起重要作用。M4-153对一些洗涤剂,包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps,有好的耐受性。M4-153对龙须菜粗多糖硫酸基团的脱硫率为79.5%。

牛流行热检测方法及疫苗研究现状

牛流行热(BEF)是由牛流行热病毒(BEFV)引起的一种急性、热性、非接触性疾病。BEF发病率高,在世界范围内流行,严重阻碍了各国养牛业的快速发展。迄今为止尚无针对BEF的有效治疗方法,检测和疫苗接种成为防控该病的关键环节。文章对近年来国内外在BEF血清学、分子生物学诊断方法以及灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗等方面的研究成果进行综述,并对不同检测方法和疫苗进行比较,旨在为快速诊断和有效防控BEF提供参考。

PCR-DGGE研究热鲜肉贮藏过程中的菌相变化

应用传统微生物培养和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法研究热鲜肉分别在5、15、25、30℃贮藏过程中的菌相变化。将热鲜肉贮藏于一定温度,每隔适当时间取出,测定菌落总数,并提取细菌DNA,进行PCR-DGGE分析。细菌计数结果表明,热鲜肉贮藏于5、15、25、30℃时,菌落总数分别在约14d、75h、19h和16h达到最小腐败量7.2(lg(CFU/g))。PCR-DGGE结果表明,热鲜肉在不同温度下贮藏时,贮藏末期优势腐败菌并不一致。在贮藏过程中主要优势腐败菌有巨大球菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属、柠檬酸细菌属、不动杆菌属和埃希氏菌属。

热休克蛋白90和凋亡抑制蛋白Livin在病理性瘢痕中的表达

背景:近年来研究表明热休克蛋白90和凋亡抑制蛋白Livin在细胞的凋亡过程中扮演着非常重要的角色,而两者在病理性瘢痕形成过程中的作用研究至今鲜有报道。目的:从基因和蛋白水平分别检测热休克蛋白90和凋亡抑制蛋白Livin在病理性瘢痕中的表达情况及两者之间的关系。方法:分别采用RT-PCR方法和免疫组织化学方法检测热休克蛋白90和Livin在24例瘢痕疙瘩、26例增生性瘢痕、22例非病理性瘢痕和20例正常皮肤组织中的表达水平。结果与结论:瘢痕疙瘩,增生性瘢痕中热休克蛋白90和Livin的阳性表达水平高于非病理性瘢痕及正常皮肤组织(P<0.05)。病理性瘢痕中热休克蛋白90和Livin表达呈正相关(rs=0.436,P<0.05)。RT-PCR检测结果与免疫组织化学结果基本一致。结果提示热休克蛋白90和Livin在病理性瘢痕的形成过程中可能起着重要作用,且二者之间可能具有协同作用。

利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp，编码755个氨基酸，其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku，pI值约为5.14；GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成；GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。

应用hiTAIL-PCR技术克隆Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶基因

实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas sp.BSi20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β-半乳糖苷酶保守片段的DAN序列;根据Marinomonas sp.BSi20584天然酶N端氨基酸残基测序结果,设计上游引物,保守DNA片段5'端设计下游引物,克隆N端到保守序列之间的DNA片段;将所得的2个DNA片段拼接并命名拼接后的片段为nbs。根据hiTAIL-PCR方法设计引物,染色体步移克隆nbs上下游片段,拼接上下游片段得到全长序列,设计引物扩增全长片段并测序。本文成功克隆了Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶的编码基因,全长1 971 bp,NCBI比对表明其编码产物为GH-42家族的一个新成员。

不对称PCR技术结合免疫层析法快速检测产志贺毒素大肠埃希氏菌

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)可分泌志贺毒素,致病性强,建立简便快速的STEC检测方法对控制食源性疾病的发生和蔓延极为重要。使用生物素标记STEC的标志性毒力基因stx1与stx2的下游引物进行不对称聚合酶链式反应,获得生物素化的目标单链DNA与聚苯乙烯微球标记的目标基因的上游引物特异性结合形成结合物,结合物上的生物素因与试纸条检测线上链霉亲和素结合而使检测线显色。通过建立的方法可成功快速检测出携带不同毒力基因的STEC,同时利用该方法对23株菌株进行stx基因的检测,结果显示该方法可准确检测到含有STEC标志性毒力基因stx的菌株,且表现出良好的特异性。

一种微腔型PCR集成芯片的设计及其热分析

设计了一种新型的硅微聚合酶链式反应(PCR)芯片。该芯片采用掺杂半导体作为加热电阻来提高加热效率,改善反应腔内的温度均匀性。集成在芯片底部的Pt温度传感器与微加热器组成温度控制单元,为PCR反应过程提供所需的三种特定温度。此外,为了便于温度校准,设计了敞开式的反应腔,其容积约1.78μL。采用集总参数法计算了芯片在加热和冷却循环过程中的功率和速率,使用ANSYS软件仿真分析了芯片的热力学特性和热循环过程,优化了加热器的设计方法并获得了合适的加热功率。最后设计了芯片版图及一套可行的工艺流程。本芯片具有体积小、反应速度快、加热效率高和高度集成化等优点。

劳盆地热液喷口沉积物微生物多样性初步研究

采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术对劳盆地热液区TVG9站位沉积物中细菌、古菌多样性进行了调查,并构建其细菌、古菌种群的16S rRNA基因文库。研究结果表明,该站位细菌包含变形杆菌(Proteobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospira),疣微菌(Verrucomicrobia)等3个类群,其中变形杆菌占据优势地位,由Alphaproteobactria,Gamaproteobactria,Deltaproteobac-tria等3个亚群组成。古菌包含泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota),其中泉古菌占优势,由MGⅠ(Marine GroupⅠ)和MCG(Miscellaneous Crenarchaeotal Group)两类群组成,而广古菌主要由MBGE(Marine Benthic Group E)组成。旨在揭示深海热液区的微生物多样性,为生态环境的研究提供理论支持。

苦参热应激蛋白HSP17.8的体外表达及生物信息学分析

利用聚合酶链式反应从苦参植物叶片中扩增出热应激蛋白基因hsp编码区序列,并成功构建了p ET22bhsp原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,在不同温度、时间和不同浓度的IPTG诱导下实现了HSP的体外表达,获得了hsp编码区序列,长度为498 bp,编码166个氨基酸,分子质量约17.8 ku的小分子热应激蛋白(HSP17.8)。对此蛋白的物理化学性质、同源进化树、二级结构以及三维结构等生物信息学分析表明:HSP17.8为稳定的亲水性蛋白,其具有多个N-豆蔻酰化位点、磷酸化位点和N-糖基化位点;与羽扇豆应激蛋白HSP的同源性最高,亲缘关系最近;HSP17.8蛋白的结构特点是α螺旋与β折叠依次出现,形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折叠方式,且同一方向的β折叠被α螺旋包裹在空间结构的内部,构成了立体结构的框架。首次从苦参中成功克隆热应激蛋白基因hsp17.8编码区序列,并在体外得到了其最佳的诱导表达条件,分析了HSP17.8的理化特性、进化关系及结构特点,为该蛋白结构、功能研究奠定了实验基础。

热不对称交错PCR克隆bapt基因侧翼序列

紫杉醇是来源于红豆杉植物的抗癌药物,广泛应用于乳腺癌和小细胞肺癌等临床治疗。巴卡亭Ⅲ-氨基苯基丙酰-13-O-转移酶基因(bapt)的表达是紫杉醇合成的瓶颈,解析该基因侧翼序列是人工调控紫杉醇合成途径的前提。采用同源克隆和热不对称交错PCR技术,扩增获得bapt基因及其侧翼的染色体序列5.6 kb。生物信息学分析表明,bapt基因含有2个外显子和1个内含子,编码区长度1 338 bp;5’端侧冀序列1 604 bp,包含启动子元件;3’端2 582 bp,含有终止子元件242 bp。发现的转录元件将应用于代谢工程改造红豆杉细胞,提高紫杉醇产量。

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。

农杆菌介导的转高赖氨酸蛋白基因(sb401)水稻T4代分析

通过农杆菌介导的方法用富赖氨酸蛋白基因（sb401）转化粳稻品种日本晴，获得了独立的10个转化株系，对转化株系进行连续自交，通过筛选得到9个纯合的T4代转化株系。Southern blotting分析发现，整合位点是随机的，并为低拷贝（1～3个）。TAIL-PCR扩增得到8个T—DNA侧翼序列，并定位于日本晴的7条染色体上。蛋白质和氨基酸测定分析发现，sb401基因对各株系的蛋白质、赖氨酸和其他氨基酸组分的提高起到了一定的作用。将杂交结果与T-DNA插入位置结合分析发现，在低拷贝的情况下，表达量的差异不明显。