家蚕热休克蛋白70家族基因的染色体定位及表达特征

热休克蛋白70家族(Hsp70)是非常保守的蛋白家族,每个物种的Hsp70家族都有多个成员,每个成员都可能具有特殊的功能。为了能够对家蚕Hsp70家族各成员进行科学命名和了解其特有的功能,分析家蚕Hsp70家族成员的编码基因及其在染色体上的定位,并通过实时荧光定量PCR方法检测这些基因在5龄第3天幼虫中肠、脂肪体和丝腺组织中的转录表达情况。家蚕诱导型Hsp70家族成员Bmhsp70A和Bmhsp70B的编码基因集中分布在第27号染色体上,有多个拷贝;组成型Bmhsp70家族成员的编码基因则分布在不同的染色体上,一般仅有1个拷贝。家蚕Hsp70家族基因中有10个能转录并翻译蛋白质产物的成员,还有1个能正常转录但不能正确翻译的假基因。实时荧光定量PCR结果表明:在常温(25℃)条件下,组成型Bmhsp70家族基因Bmhsc70-4和Bmhsc70-3的表达水平较高,而其它基因成员的表达水平则相对较低,诱导型Bmhsp70家族基因成员在常温下也有一定程度的基础表达;40℃热激2 h后,Bmhsp70家族所有基因的表达水平都有所升高,其中诱导型Bmhsp70家族基因Bmhsp70B和Bmhsp68的转录表达上升水平远高于组成型Bmhsp70家族基因Bmhsc70-3和Bmhsc70-4。不同表达类型的家蚕Hsp70家族基因成员在5龄幼虫中肠、丝腺和脂肪体中的表达情况不同,热激2 h后的表达变化规律也不完全相同,提示家蚕Hsp70家族成员具有各自特殊的功能。

简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用

目的 :利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白 70 (hsp70 )家族。方法 :根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列DIDLGTT ,DQGNRTTP ,PAYFNDS和ATKDAG设计 2对简并引物 ,以盐藻hsp70cDNA为模板进行巢式PCR扩增 ,产物经T -A克隆转化至JM1 0 9大肠杆菌中 ,经筛选后测序 ,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果 :得到 2个分别为 372bp和 35 4bp编码 1 2 6及 1 1 8个氨基酸残基的部分cDNA片段。推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性。结论 :所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b部分cDNA片段。

急性热应激对山羊血液生化指标及血淋巴细胞热休克蛋白70家族基因表达的影响

旨在研究急性热应激对山羊抗氧化能力、免疫功能和血淋巴细胞热休克蛋白70(HSP70)家族基因表达的影响。本试验选取5只健康、体况接近的(12±0.5)月龄波尔山羊×关中奶山羊杂交F1母羊,饲养于环控舱内(温度维持20℃,相对湿度60%),适应5d。第6天利用环控舱对5只试验羊进行38℃急性热应激处理12h,采集热应激前(0h,20℃)和热应激后2、4、8和12h试验羊血样。分别利用比色法测定血清抗氧化指标(总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛含量),ELISA法测定血清免疫指标(免疫球蛋白和细胞因子含量),实时荧光定量PCR法测定血淋巴细胞HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)mRNA的表达量。结果显示:1)热应激时间对血清抗氧化指标有显著影响。与热应激前0h相比,血清T-AOC(P<0.05)、SOD(P<0.05)和GSH-Px(P<0.01)活性均在热应激8h后显著下降,MDA含量在热应激4h后显著增加(P<0.05)。2)热应激时间对血清免疫指标有显著影响。与热应激前0h相比,血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-2含量分别在热应激4、8、8和4h后显著增加(P<0.05);IL-4(P<0.01)、IgG(P<0.01)、IgM(P<0.01)和IgA(P<0.05)含量分别在热应激12、4、4和4h后显著下降。3)热应激时间显著提高血淋巴细胞中HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)的表达量。HSPA1AmRNA表达量呈先升高后下降的趋势,在热应激4h时达到峰值,各检测时间点均显著高于应激前水平(P<0.01);HSPA6mRNA表达量在热应激2h时显著升高(P<0.01),4h后恢复到应激前水平(P>0.05);HSPA8mRNA表达量在热应激4(P<0.05)、8(P<0.01)、12h(P<0.01)时显著高于应激前水平。在本试验条件下,38℃急性热应激能够抑制山羊的免疫和抗氧化功能;提高血淋巴细胞HSPA1A、HSPA6和HSPA8基因的表达量,其中HSPA1A对热应激温度和时间更敏感,可作为山羊热应激早期的分子标志物。

急性冷应激对绵羊免疫功能和不同组织热休克蛋白70家族基因表达的影响

旨在研究急性冷应激对绵羊免疫功能和不同组织热休克蛋白70(HSP70)家族基因表达的影响。本研究选取8只健康、体况接近的(12±0.5)月龄小尾寒羊×湖羊杂交F1母羊,单笼饲养于保温舍内(风寒温度(-7.14±2.53)℃),适应7 d。第8天将母羊移置舍外(风寒温度(-27.40±3.12)℃)急性冷应激12 h,采集冷应激前后试验个体血样和组织样。利用ELISA法测定血清免疫指标(细胞因子和免疫球蛋白G含量),通过实时荧光定量PCR法测定不同组织(肝、肾、脾、心、背最长肌和十二指肠)HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)和热休克转录因子1基因(HSF1)的表达量。结果显示:1)与冷应激前相比,冷应激后试验羊血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL^-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6)浓度显著升高(P<0.05);血清白细胞介素-4(IL-4)和免疫球蛋白G(IgG)浓度显著下降(P<0.05)。2)冷应激后,试验羊HSPA1A mRNA表达量在肝、肾、心和背最长肌中显著升高(P<0.05);HSPA6 mRNA表达量在心和背最长肌中显著升高(P<0.05);HSPA8 mRNA表达量在背最长肌中显著升高(P<0.05),在脾和十二指肠中显著下降(P<0.05);HSF1 mRNA表达量在肝、心和背最长肌中显著升高(P<0.05),在脾和十二指肠中显著下降(P<0.05)。在本试验条件下,急性冷应激能抑制绵羊的免疫功能;HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)在各组织中的表达水平不同,其中HSPA1A对温度更敏感,宜作为绵羊冷应激的生物标记物;肝、心和背最长肌等组织中HSP70家族基因表达量升高可能与其保护组织细胞维持正常产热有关。

热休克蛋白70及其抑制剂的研究进展

热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是一种在应激条件下诱导表达的伴侣蛋白,能帮助细胞内新生蛋白折叠,蛋白细胞内运输、蛋白装配和降解,并能在应激状态下维持蛋白质构象。研究表明,Hsp70与许多疾病有关,如癌症、神经退行性疾病、异源移植的排斥、感染等,有望成为新的药物作用靶点。本文综述了Hsp70的结构、家族成员、协同伴侣(co-chaperones)成员及其功能研究进展,并介绍Hsp70抑制剂的研究现况。

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时,以0.3 mmol.L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg.L-1。Western blotting检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。

血清HSP70、NTN1、CRABP2联合检测诊断早期原发性支气管肺癌的研究

目的探讨血清中热休克蛋白家族70(HSP70)、神经轴突导向因子(NTN1)、细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)联合检测对早期原发性支气管肺癌的诊断价值。方法纳入2017年1月至2019年1月该院收治的90例早期原发性支气管肺癌患者为研究组、90例体检健康者为对照组。检测2组人员血清中HSP70、NTN1、CRABP2的表达量。用受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积(AUC)分析血清中HSP70、NTN1、CRABP2检测在早期原发性支气管肺癌中的诊断意义。结果早期原发性支气管肺癌患者血清中HSP70、NTN1、CRABP2的表达量均高于体检健康者,差异有统计学意义(P<0.05)。早期原发性支气管肺癌患者血清中HSP70的表达量与肺部感染存在相关性(P<0.05);血清中NTN1和CRABP2的表达量与累及胸膜或心包膜存在相关性(P<0.05)。血清中HSP70、NTN1、CRABP2单向诊断早期原发性支气管肺癌患者和体检健康者的灵敏度为88.00%、93.00%、87.00%,特异度分别为90.00%、93.00%、88.00%。血清中HSP70、NTN1、CRABP2联合检测对早期原发性支气管肺癌的诊断的灵敏度为88.89%,特异度为90.00%,准确度为89.44%。结论血清中HSP70、NTN1、CRABP2的表达量检测可作为早期原发性支气管肺癌的潜在标志。

气管镜窄带成像联合血清HSP70、Ntn1对支气管肺癌的临床诊断价值

目的探讨气管镜窄带成像联合血清热休克蛋白70(HSP70)、神经轴突导向因子1(Ntn1)对支气管肺癌的临床诊断价值。方法回顾性队列研究。回顾性分析2021年1月至2022年1月山西省肿瘤医院收治的96例疑似中央型肺癌合并气道阻塞患者的临床资料,所有患者均采用支气管光镜检查及窄带成像进行分析,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HSP70、Ntn1水平。以病理活组织检查结果为金标准,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析气管镜窄带成像联合血清HSP70、Ntn1水平对支气管肺癌的诊断价值。结果96例疑似患者中,男性70例,女性26例,年龄(46±5)岁;经病理确诊中央型肺癌72例,其中鳞状细胞癌43例,腺癌24例,小细胞癌3例,未分化2例,肺部良性病变24例。气管镜窄带成像诊断支气管肺癌的灵敏度、特异度、准确度分别为90.3%、79.2%、87.5%。肺癌患者血清HSP70、Ntn1水平均高于良性患者(均P<0.05)。ROC曲线显示,HSP70、Ntn1诊断支气管肺癌的最佳临界值分别为10.08 ng/ml、562.82 pg/ml,血清指标(HSP70+Ntn1)诊断支气管肺癌的灵敏度、特异度、准确度分别为93.1%、58.3%、84.4%;气管镜窄带成像联合血清指标诊断支气管肺癌的灵敏度、特异度、准确度分别为98.6%、87.5%、95.8%,其准确度高于单独气管镜窄带成像或血清指标(χ^(2)值分别为4.36、7.07,均P<0.05)。结论气管镜窄带成像对支气管肺癌具有较好的诊断价值,而联合血清HSP70、Ntn1能进一步提高临床诊断效能。