短指软珊瑚(Sinularia acuta)热休克蛋白HSP70家族特征及进化分析

热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在生物细胞或组织免受热或氧化应激等方面起着关键作用,是已知高度保守的蛋白质之一。由于全球环境持续升温,珊瑚大面积白化、死亡,珊瑚如何应对持续升温的抗逆机制是科学研究热点。本研究从高温胁迫短指软珊瑚测序蛋白序列数据库分析鉴定出了28个HSP70蛋白家族成员,均为酸性亲水蛋白,大部分蛋白质结构较为稳定。亚细胞定位表明HSP70蛋白主要分布在珊瑚细胞核、细胞质中,在线粒体、内质网上也有少量分布。信号肽预测表明, 28个HSP70蛋白成员中26个没有信号肽,大部分不属于分泌蛋白,不存在跨膜结构。系统进化树结果表明短指软珊瑚HSP70蛋白家族成员聚成5大类。短指软珊瑚HSP70蛋白家族结构和保守基序分析中预测到了10条保守基序motif分为5个亚族。短指软珊瑚HSP70蛋白家族二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,α-螺旋的含量占比大。28个HSP70家族蛋白中有25个预测到了N-糖基化位点,且位点个数在1~9范围内。28个HSP70家族蛋白均预测到磷酸化位点和O-糖基化位点,总个数分别在41~96和1~23范围内。本研究HSP70家族蛋白结果为今后珊瑚在应对全球升温胁迫中的适应机制等方面研究奠定了基础。

DnaJ热休克蛋白家族成员C9在肺腺癌中的表达及预后价值

目的探讨DnaJ热休克蛋白家族成员C9(DNAJC9)在肺腺癌(LUAD)组织中的表达、预后、甲基化情况及与肿瘤免疫浸润的关系。方法利用肿瘤基因组计划(TCGA)中LUAD的表达及临床数据分析DNAJC9的差异表达及预后价值。采用免疫组化法检测40例LUAD患者的癌组织及配对正常组织DNAJC9的蛋白表达;利用UALCAN数据库及TCGA Wanderer数据库对DNAJC9启动子区域甲基化位点进行分析;利用TIMER数据库和单样本基因集富集分析(ssGSEA)对DNAJC9表达与LUAD免疫浸润水平的关系进行分析;根据String数据库分析与DNAJC9相互作用的蛋白,利用FUNRICH富集分析工具对这些基因进行功能富集分析。结果DNAJC9在LUAD组织中的表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组化法显示,DNAJC9蛋白在LUAD组织中的表达率为80.0%(32/40),高于癌旁组织的45.0%(18/40),差异有统计学意义(P<0.05)。高表达患者的总生存率、无疾病生存率和无进展生存率均低于低表达者,差异有统计学意义(P<0.05)。DNAJC9的表达与是否存在TP53突变显著相关(P<0.05)。DNAJC9基因启动子区域甲基化水平在肿瘤组织中低于正常组织,且和该基因序列表达相关的甲基化位点与其表达水平呈负相关(P<0.05)。DNAJC9表达与LUAD免疫细胞浸润水平相关。蛋白相互作用网络分析发现,微小染色体维持复合物成分6(MCM6)、核糖核苷酸还原酶催化亚基M1(RRM1)、核自身抗原精子蛋白(NASP)、皮瓣结构特异性内切酶(FEN1)、脱氧尿苷三磷酸酶(DUT)、复制因子C亚基4(RFC4)、序列相似的家族149成员B1(FAM149B1)、MutS同源2(MSH2)、染色体的结构维持2(SMC2)、小染色体维持复合体成分2(MCM2)等蛋白与DNAJC9密切相关。富集分析显示,这些基因参与DNA合成、G2/M检查点等信号通路及多种致癌过程。结论DNAJC9的低甲基化水平使DNAJC9在LUAD组织中呈高表达,其高表达提示预后不良,与免疫细胞的浸润相关。

秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制

为探究秦川牛宰后热休克蛋白A6(heat shock protein A6,HSPA6)差异表达对肉品质的影响,以4℃条件下贮藏的秦川牛背最长肌为研究对象,测定贮藏0、2、4、6、8 d时肉品质变化情况;基于4D-非标记定量(4D-label free quantification,4D-LFQ)蛋白质组学分析宰后秦川牛背最长肌中HSP70家族成员HSPA6及相关差异蛋白表达情况。结果表明:随贮藏时间延长,HSPA6表达量呈下降趋势,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide,NADH)含量均呈下降趋势,肌纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)呈上升趋势,剪切力、离心损失率均呈先上升后下降趋势;由相关性分析结果可知,HSPA6表达量与ATP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关(P<0.05),与MFI、离心损失率呈极显著负相关(P<0.01),表明在贮藏过程中HSPA6降解与牛肉能量代谢及保水性有密切联系。蛋白质组学分析发现贮藏过程中表达量变化显著的差异蛋白中有24种与HSPA6表达相关,通过碳水化合物衍生物结合、嘌呤核苷三磷酸结合等途径引起蛋白酶体介导泛素依赖性蛋白质分解代谢、细胞蛋白分解等,造成代谢紊乱或者代谢失衡,同时还能够控制蛋白质降解、细胞凋亡等变化,进而影响肌肉结构变化,降低组织能量水平,并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。

DNAJ热休克蛋白家族成员B9的研究进展

DNAJ热休克蛋白家族成员B9(DNAJB9)是真核细胞内普遍存在的分子伴侣蛋白,参与调控真核生物的多种生理过程并发挥重要作用,包括调控内质网应激,协助蛋白质的翻译、折叠、组装、转运和降解,维持细胞稳态等。本文就DNAJB9的结构特征、生理功能及其在肿瘤、纤维性肾小球肾炎等疾病中的最新研究进展作一综述,为未来进一步探讨DNAJB9的作用和相关疾病的分子机制提供参考。

香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素-6、10及热休克蛋白70表达的影响

目的观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素(IL)-6、IL-10及热休克蛋白70(HSP70)基因及蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法受试大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组,采用综合法复制脾胃虚弱型CAG动物模型,将成模大鼠随机分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组大鼠予10 m L/(kg·d)蒸馏水灌胃,香砂六君子汤高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/(kg·d)香砂六君子汤药剂灌胃,阳性对照组予0.30 g/(kg·d)维霉素药剂灌胃,连续120 d。检测各组大鼠胃窦黏膜组织IL-6、IL-10含量,实时荧光定量PCR检测胃窦黏膜组织IL-6、IL-10和HSP70 m RNA表达,蛋白免疫印迹法检测HSP70蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠一般生存状况较差,大鼠胃窦黏膜组织IL-6 m RNA表达、IL-6含量显著升高(P<0.05,P<0.01),IL-10 m RNA表达、IL-10含量显著降低(P<0.05,P<0.01),HSP70基因和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存状况明显改善,大鼠胃窦黏膜组织IL-6 m RNA表达、IL-6含量显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-10 m RNA表达、IL-10含量显著升高(P<0.05),香砂六君子汤高、中剂量组HSP70基因和蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃窦黏模具有保护作用。

牛HSPA6蛋白特性分析及蛋白互作网络构建

通过构建牛热休克蛋白A6(heat shock protein A6,HSPA6)序列与其他生物的系统进化树,以及运用生物信息学方法分析牛HSPA6蛋白的基本理化性质、亲疏水性等,并结合蛋白互作网络,探究牛HSPA6基因编码蛋白的结构和功能特性。结果显示,牛HSPA6蛋白与羊、长江江豚等哺乳动物的氨基酸序列相似性较高;牛HSPA6蛋白分子质量为70 570.64 u,理论等电点为5.66,为酸性亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;可能存在11个得分>0.900的磷酸化位点,与N-糖基化激活位点可能位于后端碱基;牛HSPA6蛋白是一种主要由40.38%的α-螺旋和33.65%的无规卷曲组成的二级结构相对稳定的蛋白质,包含N-端核苷酸结合域和C-端多肽结合域两个主要的结构域,主要在细胞质中发挥作用;蛋白质互作网络构建结果显示,牛HSPA6蛋白主要与BAG1、DNAJA4、DNAJB1、DNAJC2等蛋白发生互作,参与腺苷酸交换因子活性、ATP酶调节活性、伴侣绑定等,表明牛HSPA6蛋白在牛机体能量代谢等过程中发挥潜在生物学功能。这些多重生物信息学分析为深入探讨牛HSPA6蛋白对肉品质的影响机制提供了理论依据。

帕瑞昔布钠超前镇痛对烧伤患者热休克蛋白70和白细胞介素-6水平的影响

目的研究帕瑞昔布钠超前镇痛对烧伤患者的镇痛作用以及对热休克蛋白70(HSP70)、白细胞介素-6(IL-6)水平的影响。方法全身麻醉下行削痂植皮术患者60例,随机均分为三组:P组麻醉诱导前30min静脉给予帕瑞昔布钠40mg,PD组分别于麻醉诱导前30min和手术结束前静脉给予帕瑞昔布钠40mg,N组手术结束前30min静脉给予生理盐水5ml。检测患者麻醉前、术毕、术后6、12、24h血浆HSP70和IL-6水平。观察患者术后2、4、8、12、24h的VAS评分。结果术后4、8、12、24hP组和PD组VAS评分均低于N组(P<0.05)。术后6、12hP组和PD组HSP70显著升高(P<0.05),且明显高于N组(P<0.05)。术后6、12、24hP组和PD组IL-6明显降低(P<0.05),N组明显升高(P<0.05),且明显高于P组和PD组(P<0.05)。结论帕瑞昔布钠超前镇痛能够增加烧伤患者HSP70的浓度,减少炎性因子IL-6的释放,并产生较好的镇痛效果。

家蚕热休克蛋白70家族基因的染色体定位及表达特征

热休克蛋白70家族(Hsp70)是非常保守的蛋白家族,每个物种的Hsp70家族都有多个成员,每个成员都可能具有特殊的功能。为了能够对家蚕Hsp70家族各成员进行科学命名和了解其特有的功能,分析家蚕Hsp70家族成员的编码基因及其在染色体上的定位,并通过实时荧光定量PCR方法检测这些基因在5龄第3天幼虫中肠、脂肪体和丝腺组织中的转录表达情况。家蚕诱导型Hsp70家族成员Bmhsp70A和Bmhsp70B的编码基因集中分布在第27号染色体上,有多个拷贝;组成型Bmhsp70家族成员的编码基因则分布在不同的染色体上,一般仅有1个拷贝。家蚕Hsp70家族基因中有10个能转录并翻译蛋白质产物的成员,还有1个能正常转录但不能正确翻译的假基因。实时荧光定量PCR结果表明:在常温(25℃)条件下,组成型Bmhsp70家族基因Bmhsc70-4和Bmhsc70-3的表达水平较高,而其它基因成员的表达水平则相对较低,诱导型Bmhsp70家族基因成员在常温下也有一定程度的基础表达;40℃热激2 h后,Bmhsp70家族所有基因的表达水平都有所升高,其中诱导型Bmhsp70家族基因Bmhsp70B和Bmhsp68的转录表达上升水平远高于组成型Bmhsp70家族基因Bmhsc70-3和Bmhsc70-4。不同表达类型的家蚕Hsp70家族基因成员在5龄幼虫中肠、丝腺和脂肪体中的表达情况不同,热激2 h后的表达变化规律也不完全相同,提示家蚕Hsp70家族成员具有各自特殊的功能。

汉坦病毒感染体外诱导VeroE6细胞热休克蛋白的表达

目的 研究汉坦病毒 (HTV)感染后对细胞应激基因表达的影响 .方法 用 HTV感染其敏感细胞株 Vero E6细胞 ,用 Western印迹杂交、RNA斑点杂交及原位杂交分别分析热休克蛋白 (HSP)的表达及编码 HSP的 m RNA水平的变化 .结果 病毒感染后细胞内 HSP70及热休克蛋白 m RNA水平均有增高 ,而 HSP6 5及 HSP2 7的表达则无明显改变 .结论 HTV感染可以直接诱导 HSP70的高表达 。

核糖体S6蛋白激酶4和热休克蛋白90在乳腺癌中的表达情况及其与患者临床病理特征及预后的关系

目的探讨核糖体S6蛋白激酶4(RSK4)和热休克蛋白90(HSP90)在乳腺癌中的表达情况及其与患者临床病理及预后的关系。方法采用免疫组织化学法检测72例手术切除的乳腺癌组织和72例癌旁组织的RSK4和HSP90蛋白的表达情况,分析不同临床病理特征患者RSK4和HSP90蛋白的表达情况,比较不同RSK4和HSP90表达水平患者的生存期。结果 RSK4蛋白在乳腺癌癌旁组织中的阳性表达率高于癌组织(P<0.05),HSP90蛋白在乳腺癌癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05),在乳腺癌组织中RSK4与HSP90蛋白的表达呈负相关(P<0.05)。不同分化程度、TNM分期患者的乳腺癌组织RSK4蛋白阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),不同肿瘤大小、有无淋巴结转移、不同组织学分化、不同TNM分期患者乳腺癌组织的HSP90蛋白阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。RSK4蛋白阳性表达患者的中位生存期为71个月,多于RSK4蛋白阴性表达患者的54个月(P<0.05),HSP90蛋白阳性表达患者的中位生存期为41个月,少于HSP90蛋白阴性表达患者的82个月(P<0.05)。结论乳腺癌组织中RSK4的表达降低,HSP90的表达升高,RSK4和HSP90在乳腺癌中可能通过某些通道存在相互影响的关系。

热休克蛋白60及重组热休克蛋白60对U937细胞IL-6分泌量的影响

目的观察重组热休克蛋白60(hsp60)对U937细胞分泌细胞因子IL-6的影响。方法对幽门螺杆菌标准株26695的基因进行定点突变,利用重叠延伸PCR法使1398和1399位点的AG突变为GC,获得重组hsp60基因片段并构建原核表达质粒pEASY-E1-rhsp60,经IPTG诱导在大肠杆菌表达突变型rhsp60,将50、100、200μg/mL的rhsp60(rhsp60组)、hsp60(hsp60组)分别与U937细胞共培养,于12、18、24 h收集上清液,ELISA法检测上清中细胞因子IL-6水平,设PBS对照组。结果 rhsp60组、hsp60组IL-6分泌水平均明显高于对照组(P均<0.05),且同时点同浓度下rhsp60组IL-6分泌水平明显高于hsp60组(P均<0.05),IL-6的分泌随着蛋白刺激浓度的升高而增高。结论 rhsp60与hsp60皆可促进U937细胞分泌IL-6,胃癌来源的rhsp60使IL-6分泌量更多。

CD44v6与热休克蛋白60在子宫颈鳞癌组织中的表达

目的:研究人子宫颈鳞癌组织中CD44v6、热休克蛋白(HSPs)60的表达状态,并探讨它们与宫颈鳞癌的关系。方法:应用LSAB免疫组织化学法检测50例宫颈鳞癌组织、15例宫颈癌旁组织及15例正常宫颈组织中CD44v6、HSP60的表达。结果:CD44v6、HSP60蛋白定位于宫颈鳞癌细胞的胞质中,在正常宫颈组织、癌旁组织及宫颈鳞癌组织中表达的阳性率分别为20.0%、33.3%、74.0%和33.3%、46.7%、88.0%。CD44v6、HSP60在宫颈鳞癌组织中表达阳性率较癌旁组织及正常宫颈组织升高,差异有显著性(P<0.01)。结论:CD44v6、HSP60在宫颈鳞癌组织中过度表达可能与宫颈鳞癌的发生、发展有密切关系。

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。

热休克蛋白70家族的功能和在神经保护中的作用

脑缺血耐受的实验研究发现,诱导热休克蛋白70家族(HSP70)的表达增加可能是内源性脑保护机制之一。HSP70包括两种蛋白:Hsp70(诱导型)和Hsc70(结构型)。本文就这两种蛋白的功能、表达的调节及在不同应激反应中表达的相关性作一综述。

简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用

目的 :利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白 70 (hsp70 )家族。方法 :根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列DIDLGTT ,DQGNRTTP ,PAYFNDS和ATKDAG设计 2对简并引物 ,以盐藻hsp70cDNA为模板进行巢式PCR扩增 ,产物经T -A克隆转化至JM1 0 9大肠杆菌中 ,经筛选后测序 ,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果 :得到 2个分别为 372bp和 35 4bp编码 1 2 6及 1 1 8个氨基酸残基的部分cDNA片段。推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性。结论 :所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b部分cDNA片段。

热休克蛋白B6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞管腔形成的影响及其机制

背景血管内皮细胞的增生和迁移是血管发生的主要环节。新近的研究发现，热休克蛋白B6（HspB6）可促进多种与血管新生相关因子的分泌，导致病理状态下新生血管的发生，研究HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞增生、迁移和管腔形成能力的影响对于脉络膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义。目的探讨HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞管腔形成能力的影响及其机制。方法对人脉络膜血管内皮细胞株进行培养和传代，取对数生长期细胞用于实验。应用逆转录PCR（RT—PCR）和流式细胞术检测HspB6mRNA及其蛋白在人脉络膜血管内皮细胞中的表达。将基质胶铺于96孔板中，凝固后加入细胞悬液，细胞密度为2×10^4个／孔，将不同质量浓度（100μg／L、500μg／L）HspB6中和性抗体分别加入培养孔，未加入HspB6中和性抗体的细胞作为对照组（0μg／LHspB6中和性抗体组），每组设3个复孔。细胞孵育12h后，采用体外三维成型法检测各组完整管腔形成的数量，以评价HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞的管腔形成能力。96孔板培养人脉络膜血管内皮细胞，培养液中加入不同质量浓度（0、50、100、500μg/L）HspB6中和性抗体孵育24h，然后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞的增生值。采用Transwell小室法检测HspB6中和性抗体作用24h后各组穿过小室膜的“贴壁”细胞数目，以评估人脉络膜内皮细胞的增生和迁移情况。收集HspB6中和性抗体干预后的人脉络膜血管内皮细胞，流式细胞术检测HspB6中和性抗体作用后各组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率。结果人脉络膜血管内皮细胞在基因和蛋白水平均可表达HspB6分子。0、100、500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目分别为（67．25±5．75）、（60．39±6．41）和（39．76±10．73）个／视野，总体比较差异有统计学意义（F=10．210，P=0．012），其中500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目明显少于0μg／LHspB6中和性抗体组，差异有统计学意义（P=0．005）。随着HspB6中和性抗体质量浓度的增加和作用时间的延长，其对细胞增生和迁移的抑制率均明显增加，差异均有统计学意义（F质量浓度=7．485，P=0．002；F时间=16．684，P=0．001）。Transwell小室法检测显示，0、50、100、500μg／LHspB6中和性抗体组细胞迁移数目分别为（14．0±2．5）、（11．1±0．8）、（6．6±0．1）、（6．7±0．2）个，其中100μg／L、500μg／LHspB6中和性抗体干预24h后细胞迁移数目较0μg／LHspB6中和性抗体组明显减少，差异均有统计学意义（均P=0．000）。流式细胞术检测结果发现，HspB6中和性抗体组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率为（22．73±2．53）％，对照组为（13．33±2．08）％，差异有统计学意义（t=4．967，P=0．008）。结论HspB6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞的管腔形成有抑制作用，可能通过抑制血管内皮细胞的增生、迁移以及促进细胞的凋亡等途径发挥效应。

Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏骨髓来源树突状细胞瘤苗的抗肿瘤免疫学效应

目的：研究Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的抗肿瘤免疫生物学效应.方法：用Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏BMDCs制成瘤苗,瘤苗的效应通过C57BL/6J小鼠肝细胞癌模型验证.皮下接种Hepal-6细胞8d后,成瘤小鼠随机分实验组,足垫部皮下注射Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏BMDCs;无血清RPMI-1640注射组、BMDCs注射组和单纯Hepal-6细胞裂解蛋白致敏BMDCs注射组.取肿瘤组织分离成细胞悬液,FACS检测CD11c＋细胞、CCR7＋细胞、CD80＋细胞和CD86＋细胞;取淋巴结、脾、肿瘤冷冻切片并采用免疫组织化学检测淋巴结、脾、肿瘤内Foxp3＋细胞浸润的改变;ELISA检测瘤内转化生长因子-p1（TGF-β1）、白细胞介素-10（IL-10）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）的表达.结果：实验组肿瘤组织比各对照组有更多的CD11c＋细胞、CCR7＋细胞、CD80＋细胞和CD86＋细胞浸润;与各组对照相比较,实验组Foxp3＋细胞在淋巴结、脾、肿瘤内浸润明显减少;实验组细胞因子TGF-β1、IL-10低于各对照组,IFN-γ、IL-2则高于各对照组.结论：Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗能促进DCs在瘤内浸润和成熟,减少Foxp3＋细胞在肿瘤内的浸润,下调免疫抑制细胞因子TGF-β1、IL-10和上调免疫促进因子IFN-γ、IL-2分泌,有较强的抗肿瘤免疫生物学效应.

Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的树突状细胞瘤苗对肝细胞癌瘤内CD25^+Foxp3^+Treg细胞的影响

目的:观察注射Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的骨髓来源树突状细胞(bone marrowderived dendritic cells,BMDCs)瘤苗对小鼠肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)瘤内CD25+叉头盒转录因子P3(forkhead box p3,Foxp3)+调节T淋巴细胞(regulatory T cells,Tregs)浸润的影响.方法:在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4,IL-4)诱导下体外扩增BMDCs,使用Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白体外致敏BMDCs制备瘤苗,荧光免疫化学染色和FACS检测致敏前后BMDCs CD11c、CCR7、CD80和CD86的表达变化.使用Hepal-6细胞皮下注射的方法制备小鼠(C57BL/6J)HCC模型,成瘤小鼠分组注射Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗(足垫部和瘤内,每7 d注射1次,共2次),并另设对照(空白对照组、BMDCs组和Hepal-6细胞裂解蛋白组).在治疗结束后9 d获取组织标本,免疫荧光组织化学染色和FACS检测瘤苗注射后肿瘤内CD8+T细胞和CD25+Foxp3+Tregs细胞的浸润情况.结果:光镜和扫描电镜显示:GM-CSF和IL-4在体外诱导扩增的BMDCs具有树突状细胞特征性的形态特征,且免疫细胞化学染色显示:该细胞表达CD11c,CCR7,CD80和CD86.使用Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs组,与对照组(BMDCs组和Hepal-6细胞裂解蛋白组)相比该组细胞CD11c(67.2±4.49 vs 52.4±5.20,58.4±4.43,P<0.01),CCR7(65.4±5.34 vs 45.9±5.04,57.0±3.46,P<0.01),CD80(62.9±4.69 vs 46.9±4.75,54.4±3.47,P<0.01)和CD86(73.3±3.58 vs 60.1±2.98,63.7±3.10,P<0.01)的表达均明显增高.使用Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗为HCC荷瘤小鼠进行注射治疗,治疗后的检测结果显示:该组小鼠瘤内CD8+T细胞的浸润明显高于对照组(空白对照组、BMDCs组和Hepal-6细胞裂解蛋白组)(55.0±4.11 vs 38.2±3.34,44.6±4.29,45.6±4.92,P<0.01),而同时瘤内CD25+Foxp3+Tregs细胞的浸润则明显低于相应对照组(0.37±0.028 vs 1.31±0.020,0.77±0.057,0.57±0.062,P<0.05).结论:使用Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗进行治疗,可增强HCC小鼠瘤内CD8+T细胞的浸润,并同时减少CD25+Foxp3+Tregs细胞的浸润,该瘤苗具有抗肿瘤免疫效果.

急性热应激对山羊血液生化指标及血淋巴细胞热休克蛋白70家族基因表达的影响

旨在研究急性热应激对山羊抗氧化能力、免疫功能和血淋巴细胞热休克蛋白70(HSP70)家族基因表达的影响。本试验选取5只健康、体况接近的(12±0.5)月龄波尔山羊×关中奶山羊杂交F1母羊,饲养于环控舱内(温度维持20℃,相对湿度60%),适应5d。第6天利用环控舱对5只试验羊进行38℃急性热应激处理12h,采集热应激前(0h,20℃)和热应激后2、4、8和12h试验羊血样。分别利用比色法测定血清抗氧化指标(总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛含量),ELISA法测定血清免疫指标(免疫球蛋白和细胞因子含量),实时荧光定量PCR法测定血淋巴细胞HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)mRNA的表达量。结果显示:1)热应激时间对血清抗氧化指标有显著影响。与热应激前0h相比,血清T-AOC(P<0.05)、SOD(P<0.05)和GSH-Px(P<0.01)活性均在热应激8h后显著下降,MDA含量在热应激4h后显著增加(P<0.05)。2)热应激时间对血清免疫指标有显著影响。与热应激前0h相比,血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-2含量分别在热应激4、8、8和4h后显著增加(P<0.05);IL-4(P<0.01)、IgG(P<0.01)、IgM(P<0.01)和IgA(P<0.05)含量分别在热应激12、4、4和4h后显著下降。3)热应激时间显著提高血淋巴细胞中HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)的表达量。HSPA1AmRNA表达量呈先升高后下降的趋势,在热应激4h时达到峰值,各检测时间点均显著高于应激前水平(P<0.01);HSPA6mRNA表达量在热应激2h时显著升高(P<0.01),4h后恢复到应激前水平(P>0.05);HSPA8mRNA表达量在热应激4(P<0.05)、8(P<0.01)、12h(P<0.01)时显著高于应激前水平。在本试验条件下,38℃急性热应激能够抑制山羊的免疫和抗氧化功能;提高血淋巴细胞HSPA1A、HSPA6和HSPA8基因的表达量,其中HSPA1A对热应激温度和时间更敏感,可作为山羊热应激早期的分子标志物。

急性冷应激对绵羊免疫功能和不同组织热休克蛋白70家族基因表达的影响

旨在研究急性冷应激对绵羊免疫功能和不同组织热休克蛋白70(HSP70)家族基因表达的影响。本研究选取8只健康、体况接近的(12±0.5)月龄小尾寒羊×湖羊杂交F1母羊,单笼饲养于保温舍内(风寒温度(-7.14±2.53)℃),适应7 d。第8天将母羊移置舍外(风寒温度(-27.40±3.12)℃)急性冷应激12 h,采集冷应激前后试验个体血样和组织样。利用ELISA法测定血清免疫指标(细胞因子和免疫球蛋白G含量),通过实时荧光定量PCR法测定不同组织(肝、肾、脾、心、背最长肌和十二指肠)HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)和热休克转录因子1基因(HSF1)的表达量。结果显示:1)与冷应激前相比,冷应激后试验羊血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL^-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6)浓度显著升高(P<0.05);血清白细胞介素-4(IL-4)和免疫球蛋白G(IgG)浓度显著下降(P<0.05)。2)冷应激后,试验羊HSPA1A mRNA表达量在肝、肾、心和背最长肌中显著升高(P<0.05);HSPA6 mRNA表达量在心和背最长肌中显著升高(P<0.05);HSPA8 mRNA表达量在背最长肌中显著升高(P<0.05),在脾和十二指肠中显著下降(P<0.05);HSF1 mRNA表达量在肝、心和背最长肌中显著升高(P<0.05),在脾和十二指肠中显著下降(P<0.05)。在本试验条件下,急性冷应激能抑制绵羊的免疫功能;HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)在各组织中的表达水平不同,其中HSPA1A对温度更敏感,宜作为绵羊冷应激的生物标记物;肝、心和背最长肌等组织中HSP70家族基因表达量升高可能与其保护组织细胞维持正常产热有关。