结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的 构建结核杆菌热休克蛋白 -65 (HSP65 )真核表达质粒 ,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达 .方法 用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因 ,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( +) ,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65 ;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549细胞 ,经G418筛选后获得抗性细胞克隆 ;用RT -PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达 .结果 经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确 ;RT -PCR检测结果发现 ,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性 .结论 真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 。

结核杆菌Hsp65和hGM-CSF双顺反子表达质粒的构建与表达

目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65GM真核表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致;免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞;ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65GM质粒,为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.