热休克蛋白70抑制剂的研究进展

热休克蛋白70(HSP70)广泛分布于细胞中,在应激状态下促进蛋白质的折叠和成熟。近年来,研究发现HSP70在多种恶性肿瘤细胞中高表达,并具有抑制细胞凋亡和干扰肿瘤免疫等功能,其可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。本文作者对HSP70结构、作用机制以及当前抗肿瘤的HSP70小分子抑制剂研究进展进行综述,并讨论目前研究面临的问题与挑战,以期为后续HSP70抑制剂的开发提供参考。

热休克蛋白70及其抑制剂的研究进展

热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是一种在应激条件下诱导表达的伴侣蛋白,能帮助细胞内新生蛋白折叠,蛋白细胞内运输、蛋白装配和降解,并能在应激状态下维持蛋白质构象。研究表明,Hsp70与许多疾病有关,如癌症、神经退行性疾病、异源移植的排斥、感染等,有望成为新的药物作用靶点。本文综述了Hsp70的结构、家族成员、协同伴侣(co-chaperones)成员及其功能研究进展,并介绍Hsp70抑制剂的研究现况。

蛋白酶体抑制剂MG-132对心肌梗死大鼠早期心功能及热休克蛋白70、热休克蛋白70羧基端相互作用蛋白的影响

目的:研究蛋白酶体抑制剂MG-132对心肌梗死大鼠心脏结构、功能的影响及其分子机制。方法:建立大鼠心肌梗死模型,干预组静脉注射MG-132(0.75mg/kg),对照组及假手术组注射生理盐水,观察各组大鼠心脏心肌结构、功能及心肌热休克蛋白70(Hsp70)、热休克蛋白70羧基端相互作用蛋白(CHIP)的变化。结果:与心梗对照组比较,MG-132干预组心肌坏死减少,左室舒张末压和血清脑钠肽水平减低(P<0.01),同时心肌组织Hsp70、CHIPmRNA和蛋白质表达水平显著升高(P<0.05)。结论:蛋白酶体抑制剂MG-132能够减轻心肌梗死、改善心功能,其机制与上调Hsp70、CHIP水平有关。

热休克蛋白70功能抑制剂亚甲蓝缓解吗啡依赖小鼠纳洛酮催促戒断症状

目的探讨热休克蛋白70(Hsp70)抑制剂亚甲蓝对吗啡依赖小鼠纳洛酮催促戒断症状的药理作用。方法采用自发活动视频分析系统(Dig Behv-LG)测定亚甲蓝2.5~10 mg·kg-1对雄性昆明小鼠自主活动的影响。给雄性昆明小鼠连续2 d sc给予吗啡,第1天吗啡剂量为每次30 mg·kg-1,第2天吗啡剂量为每次60 mg·kg-1,每天2次,建立吗啡依赖小鼠模型。每次给予吗啡前5 min,ip给予不同剂量的亚甲蓝(0,2.5,5和10 mg·kg-1)进行干预试验。第3天,sc给予吗啡60 mg·kg-1后3 h,ip给予纳洛酮8 mg·kg-1,并观察和记录30 min内小鼠的跳跃次数以及注射纳洛酮前后30 min小鼠体重的变化。结果亚甲蓝在2.5~10 mg·kg-1剂量范围内,对小鼠自主活动无明显影响。吗啡依赖小鼠纳洛酮催促戒断试验显示,亚甲蓝可以剂量依赖性地抑制小鼠的催促戒断跳跃,并明显抑制纳洛酮催促戒断小鼠的体重丢失。结论作为Hsp70抑制剂,亚甲蓝对吗啡依赖小鼠纳洛酮催促戒断症状具有明确的抑制作用。

抑制热休克蛋白70表达可增强宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性

目的探讨抑制宫颈癌Hela229细胞内热休克蛋白(HSP)70表达对顺铂(DDP)化疗敏感性的影响。方法 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)及集落克隆法测定各因素对Hela229细胞的抑制作用;溴化丙啶(PI)单染法及DAPI检测细胞的凋亡率;JC-1染色法测定线粒体膜电位(△Ψm)的变化;Western blotting测定相关蛋白的表达;建立裸鼠动物模型测定各因素体内的抑瘤作用。结果宫颈癌细胞较正常宫颈细胞高表达HSP70;当HSP70抑制剂与顺铂合用,细胞的存活率较单用顺铂显著下降(P<0.01);PI与DAPI染色实验表明HSP70抑制剂能增加顺铂诱导的细胞凋亡率;JC-1染色结果显示,HSP70抑制剂处理后顺铂组细胞线粒体膜电位发生了明显的降低。Western blotting实验结果显示HSP70蛋白表达抑制剂与顺铂合用较单用顺铂显著增加促凋亡蛋Bax/caspase-3表达及caspase-3活化;明显降低抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达。裸鼠移植肿瘤模型结果表明HSP70抑制剂与顺铂合用能增强顺铂对模型小鼠肿瘤的抑制作用(P<0.01)。结论抑制HSP70表达可增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性,机制可能是通过抑制HSP70,进而调节凋亡相关蛋白的表达,促进宫颈癌细胞凋亡。HSP70有望成为宫颈癌基因治疗的一个新靶点。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C对脑缺血再灌注大鼠脑皮质中热休克蛋白70、微管相关蛋白轻链3蛋白表达和神经元超微结构的影响

目的应用不同浓度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)干预脑缺血再灌注大鼠,检测热休克蛋白70(HSP70)和微管相关蛋白轻链3(LC3)蛋白的表达,观察其对神经元超微结构的影响。方法成年雄性SD大鼠60只,随机分成5组:假手术组(sham)、缺血再灌注组(IR),Cys C低浓度组(Cys C1)、Cys C中浓度组(Cys C2)、Cys C高浓度组(Cys C3),每组12只。采用线栓法制备脑缺血再灌注损伤模型,缺血2 h再灌注24 h后进行改良神经功能损伤严重程度评分(m NSS)。Western blotting半定量检测损伤中心脑皮质组织中HSP70、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达;免疫组织化学法检测HSP70、LC3的阳性细胞个数;免疫荧光双标记法检测皮质神经元自噬相关蛋白LC3和神经元核抗原(Neu N)共染的阳性细胞平均吸光度值;透射电子显微镜下观察神经元超微结构的变化。结果与IR组相比,Cys C1、Cys C2组m NSS评分明显减少(P<0. 05),HSP70的表达较IR组明显升高(P<0. 01);而Cys C3组m NSS评分升高,与IR组差别无显著性(P>0. 05); Cys C3组HSP70的表达明显降低(P<0. 01); Cys C各浓度组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达有不同程度的升高(P<0. 01); LC3和Neu N共染阳性细胞平均吸光度逐渐增强(P<0. 05);透射电子显微镜结果显示,Cys C1、Cys C2组神经细胞的超微结构有所改善,而Cys C3组脑皮质神经细胞损伤较重。结论 Cys C可能在一定浓度范围内对缺血再灌注损伤神经细胞有保护作用。浓度过高则导致神经细胞自噬性死亡。

脑缺血再灌注后热休克蛋白70、c-fos的表达及柘树制剂的神经保护作用

目的观察局灶脑缺血再灌注后热休克蛋白(HSP)70、c-fos的表达及其与细胞调亡的关系,探讨柘树制剂对脑缺血后神经细胞损伤的保护作用。方法采用改良Longa法制作大鼠局灶脑缺血再灌注模型。柘树制剂预处理组(柘树组)大鼠在实验前灌服柘树制剂2 m l每日3次,连用5 d。在缺血再灌注不同时点(1 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d)将大鼠处死取脑,进行HSP70及c-fos免疫组化染色、c-fos mRNA原位杂交、原位末端标记(TUNEL)及HE染色,并对其阳性结果进行半定量分析。结果脑缺血再灌注能诱导HSP70及c-fos的表达。缺血再灌注6 h组HSP70在缺血侧皮质及基底节开始表达,24 h达高峰。缺血再灌注1 h组c-fos即有表达,6 h达高峰,后逐渐下降。细胞凋亡于缺血再灌注6 h最显著。柘树组HSP70及c-fos表达的阳性细胞数均较缺血再灌注组明显增加,两组比较差异均有显著性(均P<0.01),而TUNEL阳性细胞数明显减少。结论HSP70及c-fos均参与了脑缺血的病理生理过程,柘树制剂对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

核定位信号在热休克蛋白70抑制氧化应激所致细胞核仁分离中的作用

为探讨核定位信号在热休克蛋白70(HSP70)抑制H2O2所致核仁损伤中的作用,采用分子克隆技术分别构建了4个真核表达载体,pcDNA3.1(-)-HSP70WT(HSP70野生型),pcDNA3.1(-)-HSP70ΔNLS(核定位信号缺失突变体),pEGFP-N1-HSP70WT,pEGFP-N1-HSP70ΔNLS.向传代培养的C2C12肌源细胞培养液中加入终浓度为1.0mmol/L的H2O2模拟体外氧化应激.甲苯胺蓝染色细胞核仁发现,正常细胞仅有一个位于中央的、浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离.热休克反应处理的细胞及转pcDNA3.1(-)-HSP70WT细胞则能明显抑制氧化应激所致的核仁分离.荧光蛋白示踪及核仁蛋白质免疫印迹分析显示,H2O2处理后1h,HSP70WT由正常时的细胞浆定位转为细胞核及核仁定位,而HSP70ΔNLS在H2O2处理后仍定位于细胞浆,同时丧失了抑制核仁分离的作用.上述结果提示,野生型HSP70能显著抑制氧化应激所致细胞核仁分离,核定位信号通过介导HSP70向细胞核及核仁移位而决定HSP70对核仁损伤的保护作用.

抑制热休克蛋白70表达对Eca-109细胞生长的影响

目的观察热休克蛋白70(HSP70)反义寡核苷酸阻断食管癌Eca-109细胞的HSP70表达及对细胞增殖和凋亡的影响。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot技术检测HSP70反义寡核苷酸(10μmol/L)转染Eca-109细胞后,其HSP70基因mRNA和蛋白表达的变化。观察HSP70反义寡核苷酸转染对肿瘤细胞的生长抑制效应及转染后细胞凋亡率和细胞周期分布的改变。结果HSP70反义寡核苷酸可阻断Eca-109细胞HSP70mRNA和蛋白的表达;转染后48h和72h,生长抑制率分别为25.5%和35.4%;HSP70反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于HSP70正义寡核苷酸组和未转染组(P<0.05)。结论HSP70反义寡核苷酸能抑制Eca-109细胞的生长并诱导其发生凋亡。

食管癌患者围术期血清热休克蛋白27、70、DKK-1及红细胞免疫黏附促进、抑制因子变化规律研究

目的研究食管癌患者围术期血清热休克蛋白27（HSP27）、70（HSP70）、DKK-1及红细胞免疫黏附促进因子（RFER）、抑制因子（RFIR）的变化规律。方法选取2009年11月～2011年11月于本院进行手术治疗的62例食管癌患者为观察组，同时选取同期62例健康体检人员为对照组，将对照组与观察组术前、术后1、5、10d的血清HSP27、HSP70、DKK—1及RFER、RFIR水平进行对比。结果观察组血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFIR水平均高于对照组，RFER低于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）；与术前相比，观察组术后1、5、10d的HSP27、HSP70、DKK—1及RFIR水平持续下降，而RFER则持续上升，且术后TNM分期Ⅰ期患者因子水平优于Ⅱ、Ⅲ期患者，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论食管癌患者围术期血清HSP27、HSP70、DKK-1及RFER、RFIR的变化规律可反映手术效果，并且对于疾病的诊断也有较为明显的价值。

抑制热休克蛋白70表达对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的 探讨抑制热休克蛋白 70 (HSP70 )表达对脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法 利用细胞培养、电子显微镜及流式细胞仪的方法 ,观察阻断HSP70表达后对细胞生长的影响。结果 体外培养脑胶质瘤细胞株 ,经不同浓度槲皮素作用不同时间后 ,碘化丙碇染色荧光显微镜观察发现细胞核固缩、致密和碎裂现象 ;流式细胞检测发现亚二倍体峰 ,提示出现细胞凋亡。分析细胞周期 ,发现凋亡细胞主要出现在G0 ～G1期 ,随药物浓度的增加而增加 ;观察细胞膜HSP70表达 ,经槲皮素作用后细胞表面HSP70表达显著受到抑制。透射电镜观察凋亡细胞出现核致密、核碎裂及核边聚现象。结论 脑胶质瘤细胞广泛存在HSP70过度表达 ,HSP70可以作为判断肿瘤恶性程度及预后的一个参考指标 ;槲皮素可特异性抑制体外培养的胶质瘤细胞HSP70的表达并诱导凋亡。

中药熏蒸治疗大鼠佐剂性关节炎的疗效及其与热休克蛋白70表达的关系

目的探讨中药熏蒸治疗大鼠佐剂性关节炎(AA)的疗效及部分机制。方法用随机抓取的方法将42只大鼠分为正常组、模型组、水熏组、低熏组、高熏组、西药组。模型组、水熏组、低熏组、高熏组、西药组采用弗氏完全佐剂建立大鼠AA模型。正常组和模型组大鼠不予治疗,水熏组、低熏组、高熏组大鼠分别以蒸馏水、低浓度(3.33%)中药、高浓度(6.67%)中药熏蒸,西药组采用双氯芬酸钠喷雾剂治疗,隔天测1次各组大鼠体重及双后肢足肿。1个疗程(10 d)后,取大鼠踝关节作病理检查,并比较各组大鼠滑膜组织热休克蛋白70(HSP70)表达量的变化。结果高熏组大鼠足肿胀减轻最明显,其次是西药组、低熏组、水熏组,而模型组足肿增加;相应地,高熏组大鼠关节滑膜中HSP70的产生量最多,其次也是西药组、低熏组、水熏组,正常组及模型组产生量极微。结论中药熏蒸疗法的抗炎机制可能与诱导HSP70的表达有关,且存在一定的量效关系。

热休克蛋白70对感染性脑水肿核转录因子-κB及其抑制蛋白的影响

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)对感染性脑水肿大鼠核转录因子κB(NFκB)活化及NFκB抑制蛋白α(IκBα)的影响及意义。方法制备百日咳菌液大鼠感染性脑水肿模型。72只SD大鼠随机分为对照组(NS组)、感染性脑水肿组(BE组)及热休克处理组(HSP组),各组分别于注射百日咳菌液或生理盐水4、8和24h处死,取脑组织,采用Western印迹杂交分析法检测脑组织HSP70及IκBα表达,凝胶电泳迁移率检测法(EMSA)检测神经细胞核提取物NFκB活性。结果在热休克处理后,HSP组各时间点HSP70表达明显增加,与NS组和BE组比较差异均有显著性(P均<0.01)。在BE组各时间点中,NFκB均显示明显的滞留条带,提示NFκB活性明显增强,而IκBα表达则明显减低。HSP组各时间点中,NFκB滞留条带与BE组比较明显减低,而IκBα表达则明显增强。结论HSP70表达增加可抑制NFκB活化及IκBα蛋白降解,提示HSP70对感染性脑水肿具有保护作用,其机制可能与抑制NFκB活化及IκBα蛋白降解有关。

结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用

目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组,每组6只,分别肌肉注射100μg空质粒pCI-neo、重组质粒pCI-HCA661-mtHSP70C和pCI-HCA661-mtHSP70E,流式细胞术分析小鼠脾T细胞亚群变化;ELISA法检测体外培养脾细胞上清中干扰素γ(IFNγ)的含量及免疫小鼠血清中HCA661特异性抗体的滴度;体外特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验观察融合基因疫苗对肿瘤细胞的抑制作用。结果:pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+比值与pCI-neo组比较差异有统计学意义(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值均高于pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);在抗原肽刺激下,pCI-HCA661-HSP70E免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFNγ含量较pCI-mtHCA661-HSP70C免疫组明显提高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组IFNγ含量均高于pCI-neo组(P<0.05)。pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组诱导的HCA661特异性抗体水平较pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组显著增高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组可以产生更强的CTL抗肿瘤效应。结论:mtHSP70刺激表位可以诱导机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答,发挥更强的佐剂作用。

热休克蛋白70诱导剂及其应用

热休克蛋白70(HSP70)是生物体在应激原刺激下合成的一族进化上高度保守的蛋白质。HSP70家族的功能表现在多方面:作为分子伴侣,HSP70在应激状态下帮助需要折叠的蛋白质正确折叠,加快正常蛋白质合成的恢复;在细胞保护方面,HSP70表达的增加可以增强机体对应激的抵抗力,缓解细胞所受伤害。本文主要综述HSP70的生物学特性及其细胞保护作用,并讨论了HSP70诱导剂在畜牧业中潜在的应用意义。

热休克蛋白70通过Bcl-2抑制氧化应激所致C2C12细胞凋亡

目的探讨C2C12肌原细胞内热休克蛋白70对Bcl-2表达的影响及Bcl-2对热休克蛋白70抗细胞凋亡作用的影响。方法应用Western Blotting观察Bcl-2在转染热休克蛋白70真核表达质粒(pcDNA3.1-HSP70)或其反义寡核苷酸C2C12肌原细胞中的表达;采用基因瞬间转染技术使热休克蛋白70过表达的C2C12肌原细胞内Bcl-2表达抑制,应用流式细胞术检测H2O2处理所致细胞凋亡的发生情况。结果转染热休克蛋白70真核表达质粒的C2C12肌原细胞中,热休克蛋白70和Bcl-2的表达明显高于空载体转染组(P<0.01);而转染热休克蛋白70反义寡核苷酸后,热休克蛋白70和Bcl-2的表达明显低于随机寡核苷酸转染组(P<0.01);热休克蛋白70过表达的C2C12肌原细胞分别转染Bcl-2反义寡核苷酸及随机寡核苷酸,0.5 mmol/L H2O2处理24 h,Bcl-2反义寡核苷酸转染组的细胞凋亡率明显高于随机寡核苷酸转染细胞组。结论热休克蛋白70能上调C2C12肌原细胞内Bcl-2的表达;热休克蛋白70的抗细胞凋亡功能可能与其上调Bcl-2表达相关。

携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究。方法将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70。结果成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109。HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有。结论构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础。

衰老、慢性应激与免疫细胞热休克蛋白70反应抑制

自然衰老和慢性应激都能导致免疫细胞对环境刺激的抵抗力降低。衰老和慢性应激影响免疫细胞功能的分子机制目前还不清楚。热休克蛋白（HSP）是一类在所有原核细胞和真核细胞中均有表达的高度保守的蛋白质。研究表明，HSP反应是细胞维持正常功能，对抗应激性损伤的基本保护性机制之一。在HSP家族中，热休克蛋白70（HSP70）对应激条件最敏感，且被认为是功能最重要的一类热休克蛋白。