热休克蛋白90对氧化应激激活的大鼠血管平滑肌细胞细胞外信号调节激酶的作用

目的探讨热休克蛋白90对氧化应激激活的细胞外信号调节激酶的作用。方法取SD雄性大鼠胸主动脉做原代平滑肌细胞培养。用1μmol/L可溶性鸟苷酰环化酶抑制剂6-Anilinoquinoline-5,8-quinolinedione（LY83583）处理4~12代大鼠血管平滑肌细胞不同时间,蛋白免疫印迹检测细胞内热休克蛋白90、磷酸化和未磷酸化细胞外信号调节激酶1/2。用格尔德霉素（热休克蛋白90的特异性阻断剂）预处理细胞30 min,再用LY83583处理120 min,免疫共沉淀和蛋白免疫印迹检测热休克蛋白90与细胞外信号调节激酶及磷酸化的细胞外信号调节激酶的结合,免疫荧光检测细胞核内磷酸化的细胞外信号调节激酶。结果LY83583处理120 min时细胞内热休克蛋白90表达达高峰,较0 min时增加9倍,与细胞外信号调节激酶1/2的第二个活化高峰一致。LY83583处理血管平滑肌细胞120 min后,热休克蛋白90与磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2结合较对照组升高了5.5倍（P〈0.01）,磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2的量增加了6.1倍（P〈0.01）,而细胞核内的磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2也明显增加;5μmol/L格尔德霉素预处理后,LY83583的这些效应则被阻断。结论氧化应激增加大鼠血管平滑肌细胞内热休克蛋白90,并增加其与细胞外信号调节激酶1/2及磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2的结合,促进磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2核转位。这可能是氧化应激激活大鼠中膜血管平滑肌细胞内细胞外信号调节激酶1/2信号通路活性的重要机制之一,为抗氧化应激引起的血管中膜平滑肌细胞增殖提供新的分子靶点。

热休克蛋白90-细胞外信号调节激酶-血管内皮生长因子通路在肠癌所致血管内皮细胞迁移和管状生成中的作用及机制

目的 探讨热休克蛋白90（HSP90）-细胞外信号调节激酶（ERK）-血管内皮生长因子（VEGF）信号通路在肠癌所致血管内皮细胞迁移和管状生成中作用及可能机制.方法 改变肠癌细胞HCT116中HSP90的表达水平,观察对下游分子ERK磷酸化激活和VEGF表达的影响;肠癌细胞条件培养上清刺激人脐静脉血管内皮（HUVECs）细胞,观察HUVECs细胞在该培养液中迁移和管状生成的能力;同时采用ERK抑制剂U0126和人重组VEGF蛋白,观察可否部分逆转因肠癌细胞中HSP90表达改变对血管细胞活性的影响.结果 TNM分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的肠癌患者癌组织中VEGF表达量高于对应癌旁组织.高表达HSP90增加了VEGF介导的HUVECs细胞迁移和血管生成的能力.U0126处理肠癌细胞后,抑制ERK的激活,可部分逆转因HSP90表达增加而引起的肠癌细胞中VEGF表达量的增加.结论 HSP90-ERK-VEGF通路在肠癌所致血管生成中发挥中重要作用.

右美托咪定对宫颈癌细胞HSP90/ERK通路及顺铂敏感性的影响

目的探讨右美托咪定对宫颈癌细胞热休克蛋白90(HSP90)/细胞外信号调节激酶(ERK通路及顺铂敏感性的影响。方法体外培养人宫颈癌HeLa细胞,分为对照组、顺铂组、低浓度组和高浓度组。蛋白印迹(Western blot)法检测各组HeLa细胞中HSP90、ERK、p-ERK、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNA聚合酶δ催化亚基(POLD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达情况;CCK-8法检测各组HeLa细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组HeLa细胞凋亡情况。结果与对照组相比,顺铂组HeLa细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1、PCNA蛋白水平、OD值降低(P<0.05),而凋亡率、Bax蛋白水平升高(P<0.05);随着右美托咪定的添加及浓度的升高,HeLa细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1、PCNA蛋白水平、OD值依次降低(P<0.05),而凋亡率、Bax蛋白水平依次升高(P<0.05)。结论右美托咪定可抑制宫颈癌HeLa细胞中HSP90/ERK通路,增强HeLa细胞对顺铂的敏感性。

p38MAPK信号传导通路及其与细胞凋亡

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用,MAPKs有三个主要家族:ERKs,JNKs和p38MAPKs。p38信号通路是MAPK通路的一重要分支,它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。四种已知的p38异构体包括p38α、p38β、p38γ和p38δ。多年来已发现p38MAPK通路可以由应激包括高渗、热休克、放射线和其他应激反应活化。因此,p38MAPK通路参与了多种刺激引起的信号级联反应,表明它在引起多种细胞反应中起重要作用,并且,p38在细胞凋亡和多样性变化中也显示调节效应。

GLP-1类似物利拉鲁肽对高糖诱导胰岛细胞凋亡及HSP72表达、ERK1/2通路活性的影响

目的探讨胰高血糖素样多肽(GLP)-1类似物利拉鲁肽对高糖诱导胰岛细胞凋亡及热休克蛋白(HSP)72表达、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路的影响。方法体外培养大鼠胰岛INS-1细胞,分为对照组、高糖组、利拉鲁肽低剂量组(1 nmol/L)、利拉鲁肽中剂量组(3 nmol/L)和利拉鲁肽高剂量组(5 nmol/L)。检测各组INS-1细胞凋亡、HSP72、ERK1、ERK2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达和HSP72、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax蛋白表达情况。结果与对照组相比,高糖组INS-1细胞凋亡率、HSP72、ERK1/2、Bax mRNA及HSP72、p-ERK1/2/ERK1/2、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与高糖组相比,利拉鲁肽低、中、高剂量组INS-1细胞凋亡率、HSP72、ERK1/2、Bax mRNA及HSP72、p-ERK1/2/ERK1/2、Bax蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);随着利拉鲁肽使用剂量升高,INS-1细胞凋亡率、HSP72、ERK1/2、Bax mRNA及HSP72、p-ERK1/2/ERK1/2、Bax蛋白表达水平依次显著降低(P<0.05)。结论GLP-1类似物利拉鲁肽可以抑制高糖诱导的胰岛细胞凋亡反应,并降低HSP72水平及ERK1/2磷酸化水平。

基于热休克蛋白90靶点的苦参碱衍生物C4对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及凋亡的影响

目的:研究基于热休克蛋白90靶点的苦参碱衍生物C4对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:采用分子对接和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测苦参碱衍生物C4(0、1、2、4、8μmol·L^(-1))对热休克蛋白90(Hsp90)的调控作用;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测衍生物C4(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16μmol·L^(-1))对非小细胞肺癌A549细胞活力的影响;采用克隆形成实验检测衍生物C4(0、2、4、8μmol·L^(-1))对A549细胞增殖能力的影响;采用细胞划痕实验检测衍生物C4(0、2、4、8μmol·L^(-1))对A549细胞迁移能力的影响;采用Transwell实验检测衍生物C4(0、2、4、8μmol·L^(-1))对A549细胞侵袭能力的影响;采用流式细胞术检测衍生物C4(0、2、4、8μmol·L^(-1))对A549细胞凋亡能力的影响;采用Western blot检测衍生物C4(0、1、2、4、8μmol·L^(-1))对A549细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、p-PI3K、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X基因(Bax)、B细胞淋巴瘤2相关的细胞死亡激动剂(Bad)蛋白表达量的影响。结果:衍生物C4能有效地与Hsp90蛋白通过水介导的氢键网络与天冬氨酸-51(ASN-51)、甘氨酸-135(GLY-135)、苯丙氨酸-138(PHE-138)的残基相互作用,和PHE-138苯环之间的π-π堆积相互作用有助于增强其亲和力,与空白组比较,衍生物C4可以明显的下调A549细胞内Hsp90蛋白表达(P<0.05,P<0.01);与空白组比较,衍生物C4可以明显降低细胞活力(P<0.05,P<0.01);给药24、48、72 h,衍生物C4对A549细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(12.32±0.14)、(7.79±0.16)、(3.26±0.09)μmol·L^(-1);与空白组比较,衍生物C4(2、4、8μmol·L^(-1))使A549细胞克隆形成能力明显下降(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;与空白组比较,衍生物C4可以明显抑制A549细胞的迁移、侵袭能力(P<0.05,P<0.01),其中浓度在8μmol·L^(-1)时效果最为显著(P<0.01);与空白组比较,衍生物C4可以显著诱导A549细胞发生凋亡反应(P<0.01),在0、2、4、8μmol·L^(-1)时细胞凋亡率分别为(2.28±0.35)%、(4.97±0.36)%、(8.86±0.50)%、(20.67±0.99)%;与空白组比较,衍生物C4可以明显增加Caspase-9、Bax、Bad蛋白表达量(P<0.05,P<0.01),使PI3K、p-PI3K、p-Akt、EGFR、Bcl-2蛋白表达量发生不同程度降低(P<0.05,P<0.01),Akt蛋白的表达量没有发生明显的变化。结论:衍生物C4发挥抗肿瘤的作用是通过抑制细胞活力、增殖能力、迁移和侵袭能力,并且促进细胞的凋亡反应,其发挥作用的机制可能是通过抑制Hsp90/PI3K/Akt信号通路来实现的。

丙氨酰谷氨酰胺对心肌缺血模型大鼠心肌纤维化及缝隙连接蛋白43重构的影响及其机制

目的:研究丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)诱导热休克蛋白70(HSP70)高表达对心肌缺血模型大鼠心肌纤维化及缝隙连接蛋白43(Cx43)重构的影响及其机制。方法:32只SPF级雄性SD大鼠(200±20)g,按随机数字表法随机等分为4组:对照组、盐酸异丙肾上腺素(ISO)[5mg/(kg·d)]组(模型组)、ISO[5mg/(kg·d)]+Ala-Gln[0.75mg/(kg·d)]组(干预组)、ISO[5mg/(kg·d)]+槲皮素[100mg/(kg·d)]+Ala-Gln[0.75mg/(kg·d)]+二甲基亚矾(DMSO)组(槲皮素组)。每组每天1次给予相应试剂,ISO连续给药7d后停止,余处理继续至第4周时处死大鼠。伊红素(HE)、Masson染色法观察心肌纤维化情况并计算胶原容积分数;免疫组织化学法观察心肌组织中HSP70、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)及Cx43分布,并通过软件进行半定量分析。结果:伊红素、Masson染色结果显示对照组无明显心肌纤维化,模型组和槲皮素组出现明显的纤维化,而干预组较模型组和槲皮素组心肌纤维化程度均减弱(P均<0.01),干预组与对照组的心肌纤维化程度无明显差异(P>0.05)。对照组、模型组、槲皮素组中HSP70的含量差异无统计学意义(P>0.05),而干预组中HSP70的含量较上述各组明显升高,且差异有统计学意义(P均<0.01)。心肌组织中p-ERK1/2的含量干预组较模型组、槲皮素组均降低,差异有统计学意义(P均<0.01)。Cx43含量在对照组与干预组中差异无统计学意义且呈线性规律分布,干预组较模型组和槲皮素组均增加,差异有统计学意义(P均<0.01),分布无规律性,且侧面分布相对增多。结论:Ala-Gln诱导HSP70高表达可减轻ISO诱发的心肌缺血模型大鼠心肌纤维化程度和Cx43的重构,其机制可能与HSP70下调p-ERK1/2的表达,抑制细胞外信号调节激酶通路激活有关。

p90核糖体S6激酶在耐药中的研究进展

p90核糖体S6激酶(RSK)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,其包括RSK1、RSK2、RSK3及RSK4 4种亚型。RSK是丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节酶(MAPK/ERK)信号通路下游重要的效应分子,其通过磷酸化底物介导细胞增殖、侵袭、转移、衰老等一系列生物学活动。日前,RSK在化疗耐药方面的作用逐渐清晰,而其介导耐药的机制是学界关注的重点。本文将从RSK家族结构与功能,RSK所在的MAPK/ERK信号通路及RSK在不同癌症耐药中的作用方面,总结与归纳RSK与耐药的相关性及所涉及的研究机制,并探索RSK抑制剂用于逆转化疗耐药的发展潜力。