金丝桃苷通过抑制HSP90AA1抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的基于网络药理学方法探讨金丝桃苷治疗乳腺癌的靶点及作用机制,并通过体外和体内实验进行验证。方法通过SwissTarget和TargetNet数据库获取金丝桃苷作用靶点,通过GeneCards数据库获取乳腺癌疾病相关靶点;利用STRING平台构建蛋白质相互作用(PPI)网络;基于肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析交集靶点基因与乳腺癌临床表型的关系。采用CCK-8实验及异种移植实验观察金丝桃苷对乳腺癌细胞体外和体内增殖的影响;采用Transwell实验和划痕实验观察金丝桃苷对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响;构建热休克蛋白(HSP)90α家族A类成员(HSP90AA)1过表达质粒并转染人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231,观察上调HSP90AA1表达对乳腺癌增殖、侵袭及迁移的影响。结果基于网络药理学的分析显示,金丝桃苷作用于乳腺癌的靶点共有包括HSP90AA1在内的25个靶点;TCGA数据库的临床数据表明,HSP90AA1在乳腺癌癌组织中的表达较正常乳腺组织表达明显上调(P<0.05),且其高表达与临床分期晚及预后差密切相关(P<0.05)。功能实验中,金丝桃苷显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05),并能明显抑制裸鼠乳腺癌癌移植瘤的生长(P<0.05)。金丝桃苷呈剂量依赖性抑制HSP90AA1蛋白表达(P<0.05),使用HSP90AA1过表达质粒上调HSP90AA1表达则明显逆转金丝桃苷的以上抑癌作用(P<0.05)。结论HSP90AA1在乳腺癌表达上调,并与乳腺癌的不良预后密切相关;金丝桃苷可通过抑制HSP90AA1抑制乳腺癌增殖、迁移和侵袭。

DNAJ热休克蛋白家族成员B9阳性纤维样肾小球病的临床病理特征分析

目的总结和分析DNAJ热休克蛋白家族成员B9(DNAJ heat shock protein family member B9, DNAJB9)阳性的纤维样肾小球病(fibrillary glomerulonephritis, FGN)患者临床病理改变的特征。方法回顾性分析2011年1月至2021年1月在北京大学第一医院肾内科诊断的5例DNAJB9阳性FGN患者的临床及病理资料, 总结其临床病理改变特征。结果 5例FGN患者入选本研究, 性别比为4∶1(女∶男), 中位年龄29岁(24~71岁);临床表现为肾病综合征2例, 蛋白尿3例;1例肉眼血尿, 4例轻度镜下血尿。5例患者均无单克隆免疫球蛋白血症证据。FGN肾脏病理表现多样, 光镜下可表现为系膜增生性、系膜结节状硬化、膜增生性、不典型膜性肾病样改变, 可伴有新月体形成;免疫荧光以IgG和C3在系膜区和毛细血管壁云雾颗粒样、条带样沉积为主, IgG亚型以IgG1和IgG4为主;电镜下可见直径8~30 nm纤维样物质, 主要沉积于系膜区和内皮下, 可伴有基底膜内沉积, 少见上皮下沉积。FGN患者肾脏预后不佳, 2例起病时表现为肾病综合征的患者中, 1例患者于起病1周内进展至终末期肾病, 1例患者经积极免疫抑制剂治疗后1年内进展至终末期肾病;3例起病时尿蛋白量<3 g/24 h的患者, 经肾素-血管紧张素系统阻滞剂治疗后, 2例蛋白尿缓解, 1例尿蛋白量轻度升高, 肾功能均维持稳定。结论中国FGN患者以青年起病多见, 临床主要表现为蛋白尿、微量镜下血尿。FGN诊断依赖电镜下发现系膜区、内皮下直径约10~30 nm纤维样物质, DNAJB9蛋白免疫组化检测阳性可作为确诊FGN的重要标志物。FGN患者肾脏预后较差, 目前尚无有效的针对性治疗方案。

缺氧诱导因子1α对脑缺血再灌注损伤后热休克蛋白90及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达的影响

缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是一种转录活化因子，在低氧情况下充当基因表达使者，无论是全身缺氧、脑半球缺血、脑局灶性缺血，脑组织中均有HIF1α的激活。脑梗死后缺血缺氧条件可诱导HIF-1α表达，其可与下游靶基因的缺氧诱导原件结合，通过调节其下游靶基因的表达，使缺氧的组织和细胞耐受低氧环境而发挥脑保护作用。本文对HIF-1α及其重要靶基因在急性脑卒中的表达做一综述，为临床基因治疗提供理论依据。

茯苓酸对人胰腺癌PANC-1细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的抑制作用

目的:探讨茯苓酸(PA)通过上调活化转录因子3(ATF3)和热休克蛋白家族A成员6(HSPA6)表达对胰腺癌PANC-1细胞迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)的作用,并阐明其可能的作用机制。方法:胰腺癌PANC-1细胞分为空白对照组和不同浓度(2、5、10、20、30、40和50μmol·L^(-1))PA处理组,采用CCK-8法检测各组PANC-1细胞的细胞活性。不同浓度(0、10、30和50μmol·L^(-1))PA作用于PANC-1细胞,采用Transwell小室实验检测PANC-1细胞迁移和侵袭能力,Western blotting法检测PANC-1细胞中EMT相关蛋白表达水平。将10只BALB/c nude裸鼠随机分为对照组和PA组,每组5只,裸鼠皮下注射PANC-1细胞,待肿瘤体积达到60 mm3时,PA组裸鼠腹腔注射25 mg·kg^(-1)PA,对照组裸鼠注射等量生理盐水,测量肿瘤体积和瘤质量,免疫组织化学法检测各组裸鼠移植瘤组织中Ki-67表达情况。通过GEO2R软件分析GSE64111数据集中PA处理及未处理胰腺癌细胞的差异表达基因。不同浓度(0和30μmol·L^(-1))PA作用于PANC-1细胞,采用Western blotting法检测PANC-1细胞中HSPA6和ATF3蛋白表达水平。将30μmol·L^(-1)PA处理的PANC-1细胞分为si-NC组和si-ATF3组,分别转染对照siRNA和ATF3siRNA,采用Western blotting法检测各组细胞中HSPA6和ATF3蛋白及EMT相关蛋白表达水平,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:CCK-8法,与空白对照组比较,不同浓度PA处理组PANC-1细胞的细胞活性呈浓度依赖性降低(P<0.05)。Transwell小室实验,与空白对照组比较,不同浓度PA处理组PANC-1细胞迁移能力和侵袭能力呈浓度依赖性降低(P<0.05)。Western blotting法,与空白对照组比较,不同浓度PA组PANC-1细胞中上皮钙黏素蛋白表达水平升高(P<0.05),神经钙黏素和波形蛋白表达水平降低(P<0.05)。裸鼠成瘤实验,与对照组比较,PA组裸鼠移植瘤体积和瘤质量明显降低(P<0.05);免疫组织化学,与对照组比较,PA组裸鼠移植瘤Ki-67染色较浅。GEO2R软件分析和Western blotting法,与空白对照组比较,PA处理组PANC-1细胞中HSPA6和ATF3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。Western blotting法,与si-NC组比较,si-ATF3组PANC-1细胞中HSPA6、ATF3和上皮钙黏素蛋白表达水平明显降低(P<0.05),神经钙黏素和波形蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。Transwell小室实验,与si-NC组比较,si-ATF3组PANC-1细胞迁移和侵袭能力明显增加(P<0.05)。结论:PA通过上调HSPA6和ATF3表达抑制胰腺癌细胞迁移、侵袭和EMT,从而发挥抗胰腺癌作用。

Ac-SDKP对矽肺大鼠磷酸化热休克蛋白27/SNAI1途径的调节作用

目的研究抗纤维化四肽N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)对矽肺大鼠纤维化肺组织中磷酸化热休克蛋白27(P-HSP27)及锌指家族核转录因子1(SNAI1)表达的调控,以探讨Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用。方法于2014年12月,采用一次性支气管灌注二氧化硅(SiO_(2))粉尘的方法制备大鼠矽肺动物模型,选取80只SPF级健康成年Wistar大鼠,根据随机数字表法将大鼠分为8组,每组10只。模型对照4周组(饲养4周)、模型对照8周组(饲养8周):支气管灌注生理盐水1.0 ml/只;矽肺模型4周组(饲养4周)、矽肺模型8周组(饲养8周):支气管灌注50 mg/ml的SiO_(2)混悬液1.0 ml/只;单独Ac-SDKP给药4周组(饲养4周)、单独Ac-SDKP给药8周组(饲养8周):Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔泵给药;Ac-SDKP预防治疗组:Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1)给药48 h后,支气管灌注SiO_(2)混悬液1.0 ml/只,饲养8周;Ac-SDKP抗纤维化治疗组:支气管灌注SiO_(2)混悬液1.0 ml/只4周后,给予Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1)治疗4周。蛋白免疫印迹(Western blotting)检测各组P-HSP27、SNAI1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达,免疫组织化学技术检测P-HSP27和SNAI1的表达,激光共聚焦显微镜检测P-HSP27和α-SMA共定位表达。结果与模型对照组比较,矽肺模型组大鼠矽肺纤维化区域P-HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。给予Ac-SDKP干预后,与矽肺模型8周组比较,Ac-SDKP预防和抗纤维化治疗组大鼠P-HSP27、SNAI1、α-SMAⅠ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。而单独Ac-SDKP给药组与模型对照组P-HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。激光共聚焦结果显示,矽肺模型组大鼠肺组织表达P-HSP27和α-SMA的阳性细胞多于模型对照组;与矽肺模型组比较,Ac-SDKP预防和抗纤维化治疗组表达P-HSP27和α-SMA的阳性细胞减少;与模型对照8周组比较,矽肺模型8周组结节中有部分P-HSP27和α-SMA表达的双阳性细胞。结论Ac-SDKP可能通过调节P-HSP27/SNAI1通路发挥抗矽肺纤维化的作用。

血红素氧合酶-1与血管重构

血红素氧合酶（heineoxygenase，HO）-1为热休克蛋白（HSP）家族成员之一，是一种可诱导型酶蛋白。HO-1及其酶解产物是机体最重要的内源性防御体系之一，具有抗氧化、抗增殖、抗炎、抗凋亡、抗血栓、抗血小板等重要生物学作用。现就HO-1与血管重构的研究进展进行综述。

葡萄糖调节蛋白94和78在结肠癌中的表达及临床意义

葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）和葡萄糖调节蛋白94（glucose regulated protein94，GRP94）分别是热休克蛋白（HSP）70和HSP90家族成员，是细胞为了适应内质网应激状态所产生的一组应激蛋白，在低氧、酸中毒、葡萄糖缺乏及感染等应激条件下表达增加，可在维持细胞稳态方面发挥多种功能。

血清miR-22、HSPB1水平与急性Stanford A型主动脉夹层患者预后的关系

目的探讨血清微小RNA-22(miR-22)、热休克蛋白家族B(小)成员1(HSPB1)水平与急性Stanford A型主动脉夹层(ATAAD)患者预后的关系。方法选取2020年1月~2022年5月乐山市人民医院收治的145例ATAAD患者(ATAAD组),根据院内存活状况分为死亡组22例和存活组123例,另选取同期52名体检健康者(对照组)。收集ATAAD患者临床资料,采用qPCR和酶联免疫吸附法检测血清miR-22、HSPB1水平。通过多因素Logistic回归分析ATAAD患者死亡的影响因素,ROC曲线分析血清miR-22、HSPB1水平对ATAAD患者死亡的预测价值。结果ATAAD组的血清miR-22水平低于对照组,HSPB1水平高于对照组(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,年龄增加(OR=1.077,95%CI:1.001~1.158)、心肌梗死(OR=2.963,95%CI:1.156~7.597)、休克(OR=3.178,95%CI:1.209~8.359)、心包积液(OR=2.684,95%CI:1.067~6.751)、HSPB1升高(OR=1.256,95%CI:1.013~1.557)为ATAAD患者死亡的独立危险因素,miR-22升高(OR=0.417,95%CI:0.196~0.888)为独立保护因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清miR-22、HSPB1水平单独与联合预测ATAAD患者死亡的曲线下面积分别为0.792、0.782、0.873,敏感度分别为81.82%、59.09%、86.36%,特异度分别为73.98%、88.62%、76.42%。结论血清miR-22水平降低和HSPB1水平升高与ATAAD患者预后不良独立相关,可作为ATAAD患者预后不良的辅助预测指标。

血清Hsp90α和YKL-40评估恶性腹水患者生存状况的价值研究

目的探讨血清热休克蛋白90α(Hsp90α)和人软骨糖蛋白-39(YKL-40)对恶性腹水(MA)患者生存状况的预测价值。方法收集2017年1月至2018年6月该院住院的良性腹水患者45例,MA患者105例。酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清YKL-40水平,酶联免疫法测定Hsp90α水平。比较两组患者间Hsp90α和YKL-40水平差异,及其与MA临床资料的关系,采用Kaplan-Meier、Cox多因素回归分析MA患者的生存状况及影响因素。结果与良性腹水组比较,MA组Hsp90α和YKL-40显著升高(t=8.194、6.022,P<0.01);Hsp90α高值组与低值组的年龄、淋巴结转移、多发肿瘤、腹水癌胚抗原(CEA)差异有统计学意义(χ^2=5.453、4.421、12.299、6.635,P<0.05);YKL-40高值组与低值组的组织类型、分化程度、淋巴结转移、多发肿瘤、腹水CEA差异有统计学意义(χ^2=4.786、4.292、6.507、19.250、8.731,P<0.05);Cox多因素回归分析显示年龄、淋巴结转移、多发肿瘤、家族史、Hsp90α和YKL-40水平均是影响预后的独立危险因素(P<0.05)。Hsp90α的高值组和低值组的中位生存期分别为8.7、15.4周,平均生存时间分别为(9.49±3.73)、(16.13±6.63)周,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。YKL-40高值组和低值组的中位生存期分别为9.90、12.50周,平均生存时间分别为(11.06±4.76)、(14.65±7.03)周,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论血清Hsp90α和YKL-40水平在MA患者中表达增高,对患者的生存状况有一定预测价值。

格列苯脲调控HSP70/p-Akt/MMP-9/COX-2炎性信号通路保护脑缺血再灌注损伤大鼠的神经血管单元

目的探讨磺酰脲类受体1(SUR1)-转化受体电位阳离子通道亚家族M成员4(TRPM4)特异性抑制剂格列苯脲对脑缺血再灌注损伤大鼠神经血管单元的保护作用及其机制。方法采用随机数字表法将120只雄性SD大鼠分为假手术组、模型组及格列苯脲组,每组40只。后2组采用线栓法制备成急性局灶性大脑中动脉闭塞缺血2 h再灌注模型,其中模型组于缺血2 h后给予单次腹腔注射含0.05%二甲基亚砜的生理盐水,格列苯脲组给予单次腹腔注射10 μg/kg格列苯脲(5 μg/mL)。再灌注后8 h时,采用免疫荧光双标染色及Western blotting检测各组大鼠脑组织中SUR1、TRPM4的表达,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)含量。再灌注后24 h时,采用Zea Longa评分法评估各组大鼠的神经功能缺损程度,采用干湿重法检测脑组织含水量,采用伊文思蓝(EB)染色检测血脑屏障通透性,采用尼氏染色检测脑组织中存活神经元数量,采用免疫组化染色检测IgG渗出量及离子钙接头蛋白-1(Iba-1)、环氧化酶-2(COX-2)阳性细胞的表达,采用Western blotting检测热休克蛋白70(HSP70)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)蛋白的表达。结果(1)再灌注后8 h时,与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中SUR1、TRPM4蛋白表达均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且该两种蛋白存在共定位;与模型组比较,格列苯脲组的SUR1、TRPM4蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠的MMP-9含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,格列苯脲组的MMP-9含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)再灌注后24 h时,与假手术组比较,模型组大鼠的神经功能缺损评分明显升高,脑组织含水量明显升高,EB渗出量明显升高,IgG渗出量明显升高,尼氏染色阳性神经元数量明显降低,Iba-1、COX-2阳性细胞数量明显升高,HSP70、p-Akt蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,格列苯脲组的神经功能缺损评分明显降低,脑组织含水量明显降低,EB渗出量明显降低,IgG渗出量明显降低,尼氏染色阳性神经元数量明显升高,Iba-1、COX-2阳性细胞数量明显降低,HSP70、p-Akt蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论SUR1-TRPM4在脑缺血再灌注损伤后表达升高,而其抑制剂格列苯脲对脑缺血再灌注损伤诱导的神经元及血脑屏障等神经血管单元损伤具有一定的保护作用,机制可能与调控HSP70/p-Akt/MMP-9/COX-2炎性信号通路有关。

基于网络药理学与分子对接技术探讨京尼平苷治疗脑缺血的作用机制

目的 运用网络药理学方法和分子对接方法研究京尼平苷治疗脑缺血潜在作用机制。方法 通过PubChem、PharmMapper、GeneCards、OMIM数据库分别对京尼平苷和疾病的靶点进行预测,借助Venny 2.1.0工具将二者取交集获取共有靶点,通过STRING数据库构建交集靶点的蛋白相互作用(PPI)网络,随后通过Cytoscape 3.7.2软件对核心靶点进行网络拓扑分析;基于核心靶点基因开展基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)基因富集分析。利用AutodockTool软件对所筛选的核心靶点分别与京尼平苷进行分子对接。结果 通过STRING数据库构建交集靶点的PPI网络,获得173个交集靶点,包括酪氨酸蛋白激酶(SRC)、蛋白激酶B1(AKT1)、热休克蛋白90α家族A级成员1(HSP90AA1)、PIK3R1、表皮生长因子受体(EGFR)等。京尼平苷治疗脑缺血可能通过调控磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)–蛋白激酶B(Akt)信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末化产物(AGE)–晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、Ras信号通路等多种信号通路发挥治疗脑缺血的作用。结论 预测了京尼平苷治疗脑缺血的潜在作用机制,为后续实验研究提供理论依据和研究方向。

负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞新生的影响及其机制

目的探究负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)新生的影响及其机制。方法采用实验研究方法。取第3~5代对数生长期HUVEC进行后续实验。取3批细胞,各批次细胞均分为常规培养24 h的正常对照组和单纯负压处理组以及加入17-丙烯胺基-17-去甲氨基格尔德霉素(17-AAG)培养24 h的单纯17-AAG组与17-AAG+负压处理组,另采用自行设计研发的全自动三维细胞梯度负压加载装置对2个负压处理组细胞行持续8 h的间歇负压吸引(负压值为-5.33 kPa,吸引30 s、暂停10 s),第1个批次细胞处理完成后于培养0(即刻)、24、48、72 h,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平,样本数为6;第2个批次细胞处理完成后进行划痕试验,于划痕后12 h,在倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况后计算细胞迁移率,样本数为3;第3个批次细胞处理完成后进行小管形成实验,于培养6 h,在倒置相差显微镜下观察成管情况后计算细胞成管总长度与分支节点数,样本数为3。取细胞,分为正常对照组、单纯负压处理组、17-AAG+负压处理组,同前相应组别进行处理,处理完成后,采用蛋白质印迹法检测细胞中热休克蛋白90(HSP90)、窖蛋白1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、eNOS磷酸化位点1177蛋白表达并计算eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值(样本数为3),采用免疫共沉淀(共沉淀HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS)与蛋白质印迹法检测各组细胞中窖蛋白1、eNOS的蛋白表达(样本数为3),采用免疫荧光双重染色法评估细胞中HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位情况。通过HADDOCK 2.4蛋白质-蛋白质对接程序对窖蛋白1和eNOS进行分子对接预测。数据分析采用析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD法。结果与正常对照组相比,单纯17-AAG组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低(P<0.01),单纯负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显升高(P<0.01);与单纯17-AAG组相比,17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养48、72 h均明显升高(P<0.05或P<0.01);与单纯负压处理组相比,17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低(P<0.01)。划痕后12 h,与正常对照组的(39.9±2.7)%相比,单纯17-AAG组细胞迁移率明显降低[(10.7±2.7)%,P<0.01],单纯负压处理组细胞迁移率明显升高[(61.9±2.4)%,P<0.01];与单纯17-AAG组相比,17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显升高[(37.7±3.7)%,P<0.01];与单纯负压处理组相比,17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显降低(P<0.01)。处理完成后培养6 h,与正常对照组相比,单纯17-AAG组细胞成管总长度明显缩短(P<0.05)且分支节点数明显减少(P<0.05),单纯负压处理组细胞成管总长度明显延长(P<0.01)且分支节点数明显增加(P<0.01);与单纯17-AAG组相比,17-AAG+负压处理组细胞成管分支节点数明显增加(P<0.05);与单纯负压处理组相比,17-AAG+负压处理组细胞成管总长度明显缩短(P<0.01)且分支节点数明显减少(P<0.01)。蛋白质印迹法检测显示,处理完成后,3组细胞中eNOS、窖蛋白1蛋白表达总体比较,差异均无统计学意义(P>0.05);单纯负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显高于正常对照组(P<0.01),17-AAG+负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显低于单纯负压处理组(P<0.01)。处理完成后免疫共沉淀与蛋白质印迹法检测显示,与正常对照组相比,单纯负压处理组细胞中窖蛋白1蛋白表达明显升高(P<0.01),eNOS蛋白表达明显降低(P<0.05);与单纯负压处理组相比,17-AAG+负压处理组处理完成后细胞中窖蛋白1蛋白表达明显降低(P<0.01),eNOS蛋白表达明显升高(P<0.01)。处理完成后,与正常对照组相比,单纯负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显增多,窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显减少;与单纯负压处理组比,17-AAG+负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显减少,窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显增多。分子对接预测提示,窖蛋白1与eNOS相互作用较强,抑制eNOS 1177位点的磷酸化。结论负压微环境可能通过促进HUVEC中HSP90结合窖蛋白1进而抑制窖蛋白1结合eNOS,以解除窖蛋白1对eNOS 1177位点磷酸化的抑制,从而促进HUVEC增殖、迁移和成管,最终促进HUVEC新生。

基于网络药理学、分子对接和实验验证探讨肉苁蓉苯乙醇总苷治疗不育症的作用机制

目的运用网络药理学方法推测肉苁蓉苯乙醇总苷在治疗不育症方面的潜在作用靶点和信号通路,并通过分子对接和动物体内实验来验证并进一步探讨其作用机制。方法应用TCMSP等数据库及文献收集肉苁蓉苯乙醇总苷的活性成分及潜在作用靶点,通过基因数据库(Gene Cards)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM)获取不育症疾病靶点;通过Venny 2.1软件获得交集靶点基因,结合STRING数据库绘制蛋白相互作用(PPI)网络,并通过Cytoscape 3.8.2软件筛选肉苁蓉苯乙醇总苷治疗不育症的核心作用靶点;运用DAVID数据库,分析交集基因的基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集情况。选取关键作用靶点与药物活性成分通过AutoDockTools 1.5.6软件进行分子对接验证;最后通过肉苁蓉苯乙醇总苷干预腺嘌呤诱导的不育症大鼠模型,通过反转录PCR(RT-PCR)法、蛋白质印迹(Western blotting)法验证大鼠睾丸组织中核心靶点和核心通路的表达。结果肉苁蓉苯乙醇总苷共筛选出21个潜在活性成分,62个药物靶点,7961个不育症靶点,药物与不育症交集靶点51个;核心活性成分主要为毛蕊花糖苷、松果菊苷、管花苷A等,核心靶点主要为肿瘤坏死因子(TNF)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、哈维大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、纤溶酶原基因(PLG)、热休克蛋白90α家族A类成员1(HSP90AA)等;GO功能富集主要包括蛋白水解、一碳代谢过程、细胞外基质分解等;KEGG富集通路主要包括雌激素信号通路、GnRH信号通路、氮代谢、代谢途径信号通路等;分子对接结果显示核心活性组分与不育症关键核心靶基因TNF、MMP9、HRAS、PLG、HSP90AA1的结合度高;体内实验结果表明,给予肉苁蓉苯乙醇总苷后,不育症大鼠睾丸组织ERα、HSP90 mRNA和蛋白表达升高,ERβmRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。结论肉苁蓉苯乙醇总苷治疗不育症是多靶点、多通路共同调控的结果,其作用机制可能与参与雌激素通路,调控核心靶点ERα、ERβ表达有关。