热休克蛋白gp96对巨噬细胞功能的影响

背景与目的:热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)gp96在抗原递呈和肿瘤特异性免疫治疗中具有重要作用,但其对巨噬细胞的作用机制尚待深入研究。本研究旨在探讨HSPgp96对小鼠腹腔巨噬细胞(peritonealelicitedmacrophages,PEMφ)功能的影响。方法:应用激光扫描共聚焦显微术,结合特异性荧光探针Fluo3-AM、DAF-FM-DA和H2DCF-DA,检测在HSPgp96作用下,腹腔巨噬细胞内钙离子(Ca2+)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的动态变化,并用荧光标记技术检测小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ及CD86的表达强度和分布的变化。结果:小鼠腹腔巨噬细胞受HSPgp96刺激后,细胞内Ca2+、NO和ROS的生成量都快速升高,分别在刺激后30s、80s和580s时达峰值,增幅分别为(161.06±70.99)%、(77.58±31.17)%和(647.28±185.70)%。小鼠腹腔巨噬细胞受HSPgp96刺激后MHCⅡ阳性表达率:对照组为(40.9±3.5)%,HSPgp96(60mg/L)组为(61.8±5.1)%;CD86阳性表达率:对照组为(23.1±3.1)%,HSPgp96(60mg/L)组为(54.9±2.0)%。结论:HSPgp96在体外可使小鼠腹腔巨噬细胞内Ca2+、NO及ROS生成量明显增加;使抗原递呈分子MHCⅡ、CD86的表达明显上调。

从K562细胞中提取热休克蛋白GP96及其对人树突状细胞分化和功能的影响

本研究旨在建立从K5 6 2细胞系中提取热休克蛋白GP96的方法 ,进而研究GP96对人树突状细胞分化和功能的影响。采用蛋白分离提纯技术 ,将K5 6 2细胞裂解 ,经饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、离子交换层析后提纯出热休克蛋白GP96 ,用SDS PAGE凝胶电泳和Westernblot方法对其进行鉴定。将提纯的GP96加入从正常人外周血单个核细胞诱导培养的树突状细胞 (dendriticcell,DC)中 ,通过流式细胞术检测DC细胞表型变化 ,用MTT法测定混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)。结果表明 :从 1× 10 1 0 K5 6 2细胞中能提纯出热休克蛋白GP96 6 0 - 80 μg ;加入GP96制备的HSP DC ,其细胞表面标志CD83、CD86和HLA DR的表达率比常规培养DC明显升高 ,CD1a表达率降低 (P <0 .0 5 ) ;HSP DC比常规培养DC具有更强的刺激混合淋巴细胞反应的能力 (P <0 .0 5 )。结论 :从K5 6 2细胞中可以提取出热休克蛋白GP96 ;热休克蛋白GP96可以促进树突状细胞分化成熟 。

肝癌组织热休克蛋白gp96异常表达及其临床病理学特征

目的分析热休克蛋白(HSP)gp96在人肝细胞性肝癌(HCC)及非癌组织中的表达,并探讨其与肿瘤发生、发展及预后的关系。方法采用免疫组织化学方法分别检测30例HCC癌灶组织及其自身对照的非癌组织HSPgp96的表达,并以生物素标记的HBVDNA探针检测肝癌组织中HBVDNA,分析HSPgp96表达与HBV复制及其临床病理学特征的关系。结果无论是原发性肝癌还是转移性肝癌,HSPgp96均呈较高表达;HSPgp96在肝癌灶及非癌组织表达阳性率分别为73.3%和46.7%(P<0.05)。HCC的癌灶组织中HSPgp96阳性表达与肿瘤分化程度及肿瘤大小显著相关(P<0.05),而与肿瘤数目无关(P>0.05)。HBVDNA阳性肝癌组织中HSPgp96表达显著高于HBVDNA阴性组。结论HSPgp96在HCC中过度表达,且与HCC的分化程度和大小有关,可作为肝癌早期诊断及预后判断的标志。

热休克蛋白gp96在慢性乙型肝炎组织中的检测及其意义

对慢性乙型肝炎进行gp96检测 ,探讨gp96表达状况与肝炎病变进展过程的相关性及其在抗乙型肝炎病毒免疫反应中的作用。采用免疫组织化学 (IHC)方法 ,对 77例慢性乙型肝炎病例的活检肝组织标本进行gp96检测 ,其中轻度慢性肝炎者 37例 ,中度 2 0例 ,重度 2 0例。以 16例非肝炎肝组织作为本实验对照。gp96在对照组正常肝组织和慢性乙型肝炎中的平均阳性细胞率分别为 0 5 3%和 15 94 % ,两组间具有非常显著性差异。在慢性肝炎轻、中、重三组 ,阳性细胞平均率分别为 6 14 %、2 1 39%及 2 9 18% ,统计学检验表明组与组之间有显著差异 ,gp96表达率随着炎症程度的加重而上升。

热休克蛋白gp96作为抗原载体的研究进展

gp96是存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为 96kD的热休克蛋白 (又称GRP94)。它属于HSP90家族 ,是胞质HSP90的旁系同源蛋白。研究证实从小鼠肿瘤组织中分离的gp96注射小鼠后 ,可使小鼠获得针对该肿瘤细胞的特异细胞免疫力。随后发现这种特异性免疫不是由gp96引起 ,而是由其结合的小肽诱发。gp96受体的发现给这种现象的解释提供了线索。人们提出了多种假说来解释这种现象 ,其中一些得到了广泛的支持。另外 ,gp96还参与免疫调节过程。

鼠肝细胞癌变发生过程中热休克蛋白gp96及其基因的动态表达

目的:探讨肝细胞癌变过程中热休克蛋白(HSP)gp96及基因的动态表达与变化。方法:以2-乙酰氨基芴(2-FAA,0.05%)喂饲SD大鼠诱发肝癌,观察肝病理组织学(HE染色)和总RNA的改变,以巢式逆转录酶链反应扩增gp96基因片段;以免疫组化分析肝细胞癌变过程中gp96的动态表达。结果:SD鼠在喂饲2-FAA后,在诱癌早期肝细胞发生颗粒样变性,中期出现不典型增生,后期见大量癌巢结节。癌变过程中肝组织gp96-mRNA表达明显增加,且显著高于对照组肝组织(P<0.01);正常肝gp96蛋白表达较少,肝细胞癌变过程中gp96表达呈显著的梯度增加。结论:gp96参与肝细胞的癌变过程,癌变初期的过度表达有助于肝癌的早期诊断。

热休克蛋白gp96 3′UTR作为ceRNA通过miR-642a调控DOHH的表达

热休克蛋白gp96在肝脏等多种肿瘤中过量表达,与肿瘤的恶性程度和患者不良预后呈显著相关性,其在肿瘤发生发展中作用机制有待深入探讨.通过生物信息学技术预测、荧光素酶报告基因检测、免疫印迹分析、实时定量PCR、RNA干扰,研究gp96 3′UTR作为ceRNA(competing endogenous RNA)对miR-642a和脱氧羟腐氨酸羟化酶(deoxyhypusine hydroxylase,DOHH)表达的影响.研究结果显示,miR-642a特异性靶向的野生型gp96 3′UTR,而不是miR-642a结合位点突变的gp96 3′UTR,可吸附下调miR-642a并同时上调miR-642a靶基因DOHH的表达,进一步研究发现gp96 3′UTR对DOHH的调控依赖于miR-642a.实验还发现DOHH并不影响gp96的表达.Gp96通过ceRNA上调DOHH的表达,为研究gp96促进肝癌等肿瘤的发生发展提供了新思路.

联合使用低剂量环磷酰胺有效增强热休克蛋白gp96免疫佐剂功能

前期研究发现热休克蛋白gp96作为分子伴侣,能特异结合乙肝病毒(HBV)表位肽,并将结合的多肽交叉呈递给MHCⅠ类分子,从而激活病毒特异性CD8+T细胞(CTL)。在此基础上,研究BALB/c小鼠模型联合低剂量环磷酰胺(cy-clophosphamide,CTX)对热休克蛋白gp96免疫佐剂功能的影响。以gp96或其N端片段(N355)与H-2Kd限制的乙肝病毒核心蛋白表位HBcAg87-95作为佐剂联合低剂量CTX免疫BALB/c小鼠。联合使用低剂量CTX的试验组CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞、乙肝抗原特异T细胞比例显著高于未使用CTX的对照组(P<0.05),且联合使用CTX的试验组CD4+CD25+调节性T细胞(TRegulatory Cells,Treg)比例显著低于单独使用gp96和N355试验组(P<0.05),说明低剂量的CTX能特异性抑制Treg从而导致T细胞的增加。以上研究表明联合使用低剂量的环磷酰胺能有效增强gp96免疫佐剂功能,这为进一步优化gp96佐剂疫苗的使用提供了依据。

热休克蛋白gp96在恶性肿瘤中的研究进展

热休克蛋白90B1又称为糖蛋白96(gp96).gp96属于热休克蛋白90家族,是一种高度保守且普遍存在的糖蛋白.作为一种内质网蛋白,gp96在维持内质网稳态、内质网应激、钙稳态等方面起着重要的调控作用,这些调控网络在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用.gp96作为分子伴侣在稳定和激活客户蛋白等方面有众多报道,其中包括HER2、整合素和Toll样受体等多个客户蛋白.大量研究表明,gp96在肝癌、乳腺癌、胃癌等不同类型的肿瘤中高表达,并在肿瘤的生长、侵袭和转移等方面起着重要的作用.本文从gp96的基本结构和功能及其在肿瘤发生发展中的作用等方面进行综述,并着重阐述细胞膜gp96相关的研究进展.最后,重点介绍基于胞膜gp96结构所设计的选择性小分子抑制剂、抗体和多肽等药物在肿瘤靶向治疗中的潜在应用.

人腺样囊性癌细胞热休克蛋白gp96肽复合物的纯化和鉴定

目的:建立从人腺样囊性癌细胞系中提取gp96-肽复合物的方法。方法:培养人腺样囊性癌(ACC-M和ACC-2)细胞系,经裂解、盐析、过Con A亲和柱、透析、DEAE-Sepharose离子交换层析后得到目的蛋白,对进行蛋白质浓度、分子量及性质进行鉴定。结果:取湿重同为1g的两株细胞,纯化后得到总量分别为77μg和85μg的产物,电泳结果显示纯化蛋白分子量约为96KD,western blot显示产物是gp96-肽复合物。结论:采取上述方法从腺样囊性癌细胞中得到了较高纯度的gp96-肽复合物。

热休克蛋白gp96在人胃癌组织中的表达及意义

目的探讨热休克蛋白gp96在人胃癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组化S-P法检测对60例胃癌手术根治标本及癌旁组织进行HSPgp96检测。结果HSPgp96在胃癌和癌旁组织中阳性表达率为65%和31.7%,差别有统计学意义(P<0.05)。HSPgp96阳性表达率随着肿瘤病程进展(TNM分期)而增加(P<0.05);在低分化型胃癌中的阳性表达率高于中、高分化型胃癌(P<0.05);在伴淋巴结转移肿瘤中的表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05);但HSPgp96阳性表达率与肿瘤的大体形态、侵犯深度不同之间的差别无统计学意义(P>0.05)。结论热休克蛋白gp96可作为早期胃癌的诊断,临床治疗,手术成功率,和胃癌预后判断的新的综合参考指标。

利用CRISPR/Cas-9技术抑制热休克蛋白Gp96的表达对小鼠酒精性肝纤维化的影响

目的探讨热休克蛋白Gp96对小鼠酒精性肝纤维化的影响。方法健康雄性C57BL/6 J小鼠220只,随机分为4组:正常对照组(n=10),生理盐水+酒精诱导纤维化组(n=70)。尾静脉注射CRISPR表达质粒Gp96-sgRNA3+酒精诱导肝纤维化组(n=70),腹腔注射核因子κB(NF-κB)抑制剂PDTC+酒精诱导肝纤维化组(n=70)。于酒精诱导第8周眼球取血后处死各组小鼠,测定各组小鼠血清谷草转氨酶(AST)活性,HE染色检测各组小鼠肝脏病理变化,天狼猩红染色检测各组小鼠肝纤维化情况,过碘酸-雪夫(PAS)染色检测各组小鼠肝糖原变化情况;免疫印迹法检测小鼠肝脏Gp96和转化生长因子β1(TGF-β1)的表达变化。结果与正常对照组相比,其余3组AST酶活性显著上升,肝纤维化加重,糖原显著减少(P<0.01);与生理盐水+酒精组相比,注射质粒Gp96-sg RNA3+酒精组和注射NF-κB抑制剂+酒精组AST上升更为明显,肝纤维化更严重,糖原减少更多,Gp96表达显著下降,TGF-β1表达显著增加(P<0.01或P<0.05)。结论尾静脉注射CRISPR表达质粒Gp96-sgRNA3显著抑制了小鼠肝脏Gp96的表达,促进了小鼠酒精性肝纤维化程度,NF-κB信号通路对Gp96的表达起到一定的调控作用。

热休克蛋白Gp96在肝癌、肝纤维化、乙型肝炎中作用的研究进展

目的热休克蛋白(HSP) Gp96,又称HSP90β1,是存在于真核生物细胞内质网中的相对分子质量为96 000的HSP,是HSP90家族的重要一员,其在肝脏疾病中的作用是近年来研究的热点。Gp96参与包括肝癌在内的多种肝脏疾病的发生、发展过程,且在不同肝脏疾病中有着不同的作用。

小鼠急性酒精性肝损伤过程中热休克蛋白Gp96的表达变化及意义

目的研究小鼠急性酒精性肝损伤过程中热休克蛋白Gp96的表达变化及意义。方法选取健康昆明雄性小鼠50只随机分为2组:正常组(n=10)、实验组(n=40)。正常组小鼠不做处理,实验组小鼠酒精灌胃(红星二锅头,16ml/kg)诱导小鼠急性肝损伤,分别于灌胃后6、12、18和24h将各组小鼠眼球取血并分离血清,检测谷丙转氨酶(ALT)活性;颈椎脱臼处死小鼠分离提取肝脏,石蜡切片苏木精-伊红染色(HE染色)观察各组小鼠肝组织病理学改变,蛋白免疫印迹法检测小鼠肝组织中热休克蛋白Gp96的表达变化。结果ALT检测结果显示,酒精灌胃后,随着时间增加,血清ALT酶的活性持续升高,18h后达最高值(P<0.01),随着肝损伤的修复,血清ALT酶的活性开始出现下降;HE染色结果显示,酒精灌胃后,随着时间的增加,肝组织出现了不同程度的损伤,18h后损伤积分达到最高值(P<0.01),随着肝组织修复损伤积分有所降低:免疫印迹结果显示,酒精灌胃后Gp96的蛋白表达量随着时间的增加持续升高,18h后达最高值(P<0.01),随着肝损伤的修复,Gp96蛋白表达量开始下降。结论小鼠急性酒精性肝损伤过程中Gp96的变化显著表现为先升高后降低,Gp96可能在肝损伤后的修复中起重要作用。

人肾癌组织中热休克蛋白gp96-肽复合物提取、纯化及体外的免疫效应

目的建立从人肾癌组织中提取、纯化热休克蛋白(HSP)gp96肽复合物的方法,并检测其体外免疫效应。方法采取三步蛋白纯化法从人肾癌患者肿瘤组织中提取、纯化HSPgp96肽复合物,SDSPAGE、Westernblot鉴定HSPgp96肽复合物。应用酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测HSPgp96肽复合物、单纯多肽产生γ-干扰素效应T细胞频数的体外免疫活性。结果应用该方法提取的蛋白质经SDSPAGE和Westernblot特异性鉴定,证实是HSPgp96肽复合物;蛋白得率为每g湿重肾癌组织可纯化HSPgp96肽复合物40～60μg。γ-干扰素ELISPOT检测,HSPgp96肽复合物组产生γ-干扰素效应T细胞频数最高(287.50±22.34),以后依次为单纯多肽组(135.25±12.80)、阳性对照组组(102.25±14.76)、阴性对照组(35.50±11.10),各组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);HSPgp96肽复合物组与单纯多肽组、阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);单纯多肽组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论三步蛋白纯化法不仅操作简便、重复性高,而且提取的HSPgp96肽复合物具有高获率、高纯度、高特异性及高免疫效应等优点。

热休克蛋白gp96在原发性肝癌组织中的检测及其意义

热休克蛋白gp96的发现为肿瘤和病毒性肝炎等传染性疾病的免疫治疗开辟了新的途径.用免疫组织化学方法对gp96在原发性肝癌组织中的表达进行检测,探讨gp96在抗肝癌免疫反应中的作用.

大鼠肝细胞癌变过程中热休克蛋白gp96的异常表达及变化特征

目的探讨大鼠肝细胞癌变过程中热休克蛋白(HSP)gp96的表达与变化特征。方法以2-乙酰氨基芴(2-FAA)喂饲SD大鼠诱发肝癌,以免疫组化染色及Western blot观察大鼠肝组织中gp96蛋白的定位及表达水平。结果SD大鼠在喂饲2-FAA后,在诱癌早期肝细胞发生颗粒样变性,中期出现不典型增生,后期见大量癌巢结节。癌变过程中肝组织gp96蛋白主要定位于细胞浆,表达水平从变性组到癌前组到癌变组呈明显的梯度增加,均显著高于对照组肝组织(P<0.01)。结论gp96参与肝细胞的癌变过程,癌变初期的过度表达有助于肝癌的早期诊断。

热休克蛋白HSPgp96在骨肉瘤中的表达及意义

目的观察热休克蛋白(HSP)gp96在骨肉瘤中的表达及其临床意义。方法30例骨肉瘤患者为观察对象(骨肉瘤组),10例骨软骨瘤患者切除肿瘤后的基底部周围正常骨组织为对照组。用SP法免疫组织化学标记HSPgp96及C-erbB2基因。结果各组织学类型的骨肉瘤细胞均有HSPgp96阳性表达。骨肉瘤组HSPgp96及C-erbB2的表达均明显高于对照组(P<0·05)。分化较差的骨肉瘤HSPgp96的表达强度明显高于分化较好者(P<0·01)。结论HSPgp96在骨肉瘤的增殖过程中发挥重要作用。

N-糖基化修饰对热休克蛋白gp96免疫学功能的影响

文中旨在以N-糖基化位点突变的重组热休克蛋白gp96为对象,研究N-糖基化修饰对其免疫功能的影响。首先利用昆虫表达系统表达野生型和突变型gp96蛋白,并检测其糖基化水平。进一步通过体外和体内实验,利用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠CD8^(+)IFN-γ^(+)T细胞亚群和IFN-γ的分泌,查明糖基化对gp96抗原呈递功能的影响,进一步用ATPase试剂盒检测gp96的ATPase活性。最后通过小鼠免疫实验探究糖基化对gp96疫苗佐剂功能和活化流感疫苗特异性T细胞的影响。结果显示,N-糖基化修饰位点突变后,重组gp96蛋白总含糖量下降了27.8%。与野生型重组蛋白相比,突变gp96的抗原呈递能力减弱,同时ATPase活性明显降低。同时与野生型重组gp96相比,突变gp96佐剂活化流感疫苗特异性T细胞水平也明显减少。这些结果表明,N-糖基化修饰参与调节gp96的ATPase活性和抗原呈递功能,进而影响其疫苗佐剂功能,为开发基于gp96的佐剂疫苗提供了依据。