嗜热厌氧杆菌乳酸脱氢酶敲除对乙醇发酵的影响

为提高乙醇产率,通过同源重组的方式敲除嗜热厌氧杆菌乳酸支路中的乳酸脱氢酶基因,得到了嗜热厌氧代谢工程菌Δldh突变株.应用葡萄糖、木糖、葡萄糖/木糖混合糖3种碳源,分别对Δldh突变株与野生菌进行分批补料发酵产乙醇的研究.结果表明,与野生菌相比,Δldh突变株不仅显著提高了乙醇产率,而且提高了糖的消耗速率;Δldh突变株与野生菌都能以葡萄糖和木糖为基质生长,而与木糖为单一碳源相比,在葡萄糖/木糖共发酵时,木糖消耗速率有所降低;在以葡萄糖为单一碳源时,Δldh突变株的乙醇质量浓度和产率达到最高,分别为25.93 g/L和0.39 g/(L.h).

甘蔗渣酸解及其水解液发酵嗜热厌氧杆菌产乳酸的研究

摘要：本试验用0．5％HCl、2．1％稀H2SO4和超声一微波法对甘蔗渣进行水解，结果表明稀H2SO4法水解的总还原糖得率明显提高，达到了141．8mg／g，且水解液发酵嗜热厌氧杆菌的乳酸产率最高，发酵液中乳酸含量达2．65g／L。文中对实验室条件下几种方法水解甘蔗渣的优劣进行了讨论，认为稀H2SO4法能较高效地在实验室里水解甘蔗渣。

有机氮源添加对嗜热厌氧杆菌产乙醇的影响

嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27Δldh)能利用葡萄糖与木糖发酵,是纤维素乙醇生产的理想菌株。为进一步改善菌株在不同底物(葡萄糖、木糖和混合糖)条件下的乙醇发酵性能,本文探究了有机氮源对嗜热厌氧杆菌发酵产乙醇的影响。结果表明,4 g/L 酵母提取物和2 g/L 胰蛋白胨为最佳的有机氮源组成,在不同底物条件下菌株生物量、底物利用率、乙醇浓度和生产强度与对照相比,分别提升41%~ 109%、50%~ 56%、53%~ 76%和91%~ 111%。此外,本研究还证实了充足的有机氮源供给对于T. aotearoense SCUT27Δldh 的葡萄糖和木糖高效共利用起到重要的作用。

嗜热厌氧杆菌分解代谢物调控蛋白A的克隆鉴定

分解代谢物调控蛋白A(CcpA)在低GC含量的革兰氏阳性菌株中,是一类非常重要的全局调控蛋白。本研究中,克隆获得了嗜热厌氧杆茵CcpA的编码基因及其上下游各约400 bp片段的基因序列。研究表明,克隆所得的ccpA基因编码长度为336个氨基酸的蛋白质,其理论等电点为5.69。序列比对分析结果显示,其N端的DNA结合位点具有非常高的序列保守性。在CcpA启动子上游含有cre序列,表明该基因转录存在自体调控。此外考察了克隆所得的CcpA编码基因在葡萄糖存在下,工程茵B.subtilis TA-1中amyE基因的表达及酶活均受到抑制。ccp4基因敲除的枯草芽孢杆菌中过量表达克隆所得的CcpA,证明所获蛋白在葡萄糖存在下,能够有效抑制淀粉酶的活力,且对枯草芽孢杆茵的生长产生负影响。

嗜热厌氧杆菌X514生长及代谢的初步研究

嗜热厌氧杆菌X514(Thermoanaerobactersp.X514)是纤维素乙醇生产中最具潜力的菌株之一。对X514在3种培养基中的生长及代谢特征进行分析后发现,培养基1190比GS-Ⅱ和2473更适合运用于X514的代谢研究及乙醇发酵。其次,分别在1190培养基中添加不同浓度的酵母提取物和葡萄糖,对X514的生长及代谢作进一步研究。结果表明,在0.5-2 g/L范围内,酵母提取物浓度的增加有助于提高X514的生物量,乙醇等产物的产量及乙醇产率,说明酵母提取物对X514生长及乙醇发酵有促进作用;在2-10 g/L范围内,葡萄糖浓度的增加可提高乙醇等产物的产量而不会改变各产物的产率;糖消耗量并不随着初始底物浓度的增加而线性增长,而是在一定阶段趋于消耗最大值。反映了X514在底物充分的条件下,只有通过改进其他制约条件,才有可能提高底物的利用率及产物的产率。

Pro-sigmaK inhibitor-BofA基因敲除对嗜热厌氧杆菌SCUT27葡萄糖和木糖利用的影响

嗜热厌氧杆菌SCUT27(Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27,SCUT27)能同时利用木糖和葡萄糖,是发酵廉价木质纤维素获得乙醇及乳酸的优势菌株。为了提高该菌株对木糖和葡萄糖的利用效率,对其在葡萄糖、木糖和混合糖下不同时间点转录组数据分析的基础上,敲除pro-sigmaK抑制因子BofA(pro-sigmak processing inhibitor BofA,BofA)基因,获得基因工程菌ΔbofA。摇瓶发酵结果显示,与出发菌相比,当以木糖为唯一碳源时,突变株ΔbofA对木糖的代谢速率提高51.43%,乳酸产率提高23.53%;以混合糖(葡萄糖:木糖为=1:1)为碳源时,ΔbofA对木糖的代谢速率提高44.44%,乳酸和乙醇的产率分别提高43.75%和20.00%。由此可见,pro-sigmaK抑制因子BofA是木糖利用的负调控因子,其功能有待进一步研究。

嗜热厌氧杆菌X514的盐度和pH生长范围研究

[目的]研究嗜热厌氧杆菌X514的盐度及pH生长范围。[方法]设置不同Nacl浓度梯度及pH范围,分别将X514在不同盐度及起始pH培养基中培养,测定不同时段下X514的生长情况。[结果]X514的最适生长盐度为0 g/L,最适生长pH范围为pH 7~9。[结论]X514的生长受盐度影响明显,其最适生长pH范围与其他嗜热厌氧菌相似。

嗜热厌氧杆菌X514在不同氮源培养基中的生长及代谢研究

[目的]研究适宜嗜热厌氧杆菌X514生长和代谢的氮源培养基添加物。[方法]比较X514在添加不同氮源添加物(有机氮源蛋白胨、酵母提取物和无机氮源NH4C l)的基本培养基中的生长和代谢。[结果]酵母提取物和蛋白胨相对于无机氮源都能促进X514的生长,其最大生长速率是0.150 h-(添加5 g/L的酵母提取物培养基),同时X514在高浓度蛋白胨培养基中(5 g/L)的生长相对于低浓度蛋白胨培养基(0.5 g/L)延迟4 h左右;酵母提取物能有效地促进X514产乙醇,与含等量的蛋白胨培养基相比其乙醇转换率(mol产出乙醇/mol消耗的葡萄糖)平均高30%左右。[结论]酵母提取物可以更高效地促进X514的生长和乙醇产出。

napF3调控腾冲嗜热厌氧杆菌热适应机制

【目的】研究腾冲嗜热厌氧杆菌napF3在不同温度下的功能。【方法】通过同源重组构建腾冲嗜热厌氧杆菌的ΔnapF3株,观察并比较其在50、60、75和80℃下野生株和ΔnapF3株的生长趋势。通过转录组测序确定ΔnapF3株与野生株在75℃的差异表达基因。采用荧光定量PCR分析野生株和ΔnapF3株中13个基因和3个sRNA在50、60、75和80℃下的转录水平。【结果】成功构建了ΔnapF3株,生长曲线结果显示其在50℃和80℃不生长,60℃和75℃生长速度显著减缓。转录组结果显示:有899个基因表达发生差异,包括363个上调基因和536个表达下调基因,这些差异表达基因主要富集在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、ABC运输工具、双组分系统、脂肪酸合成、硫胺素代谢等途径,并发现与嗜热机制相关的13个基因和3个非编码RNA的转录水平在特定温度下发生了变化。【结论】腾冲嗜热厌氧杆菌napF3在热适应过程中发挥重要作用。

基于转录组分析的腾冲嗜热厌氧杆菌thiD的热适应机制研究

ThiD在腾冲嗜热厌氧杆菌中由thiD编码,是硫铵素合成途径的关键酶。thiD的结构和功能已在真菌、酵母菌和植物中得到阐明。然而,thiD在嗜热生物中的功能仍不清楚。【目的】探讨腾冲嗜热厌氧杆菌的嗜热机制并揭示thiD在不同温度下的功能及在热适应调控中的作用。【方法】利用同源重组技术构建腾冲嗜热厌氧杆菌的ΔthiD株,观察并比较野生株和ΔthiD株在50、60、75和80℃下的生长趋势。通过转录组测序分析ΔthiD株与野生株在75℃的差异表达基因。通过实时荧光定量PCR分析比较野生株和ΔthiD株中13个基因和3个sRNAs在50、60、75、80℃下的转录水平。【结果】成功构建了ΔthiD株,生长曲线结果显示其在50℃时,ΔthiD株生长速率与野生株无显著差异。然而,在60℃和75℃时,ΔthiD株生长速度明显慢于野生株。另外,ΔthiD株在80℃时几乎不生长。转录组结果显示,与野生株相比,ΔthiD株有503个差异表达基因,其中包括278个上调差异表达基因和213个下调差异表达基因。KEGG分析表明,以下途径与热适应有关,包括硫胺素代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢、肽聚糖生物合成、脂肪酸代谢途径、氨基酸代谢途径、双组分系统、DNA复制、同源重组、错配修复、磷酸转移酶系统。通过实时荧光定量PCR分析发现,在野生株和ΔthiD株中与嗜热机制相关的13个基因和3个sRNAs在特定温度下的转录水平发生了变化。【结论】thiD在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应过程中发挥重要作用。本研究为揭示thiD在不同温度下的功能和在热适应过程中的调控机制提供实验数据和理论依据。

一株高效降解木糖的耐酸、嗜热厌氧杆菌的生理特性及产物分析

【目的】分离高效降解木糖的嗜热厌氧杆菌菌株,用于发酵生产生物燃料乙醇,为后继的构建基因工程菌株及联合生物工艺提供材料。【方法】运用亨盖特厌氧操作技术从胜利油田油层采出液两年的富集样中分离到一株嗜热厌氧杆菌xyl-d。采用形态学观察、生理生化指标鉴定及基于16S rRNA的系统发育学分析确定其分类地位。【结果】菌株xyl-d为革兰氏阴性厌氧杆菌,菌体大小为(1.35-5.08)μm×(0.27-0.40)μm,单生、成对或成簇生长,芽胞圆形,端生。温度生长范围30-85℃(最适温度65℃);pH范围3.0-10.0(最适pH 7.5);NaCl浓度范围0%-4%(最适NaCl浓度2.0%)。发酵D-木糖的产物是乙醇、乙酸、CO2及少量的异丁醇、丙酸。菌株xyl-d的(G+C)mol%含量为45.6%,与热厌氧杆菌属模式菌株威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)DSM10319T及嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)DSM2246T的16S rRNA序列相似性均为99.3%。菌株利用D-木糖产乙醇的最佳初始pH为8.5;少量酵母粉能刺激生长并显著提高发酵D-木糖的产醇率,使乙醇成为主要的发酵产物;培养基中乙醇浓度达到7%(V/V)时菌体生长受到抑制,最佳生长条件下D-木糖的降解率可达91.37%,最佳产醇条件下发酵1摩尔D-木糖可产生1.29摩尔的乙醇。【结论】菌株xyl-d是从特殊生境(油藏)中分离到的一株高效降解D-木糖的耐酸、嗜热的厌氧杆菌,其为半纤维素降解产乙醇的联合生物工艺提供了菌源。

腾冲嗜热厌氧杆菌Cmr3的生物信息学分析及原核表达

本研究旨在阐明腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统Cmr蛋白在嗜热机制中的作用,利用PCR方法扩增出腾冲嗜热厌氧杆菌的cmr3基因,构建原核表达载体,将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中,通过诱导表达出Cmr3蛋白;并利用生物信息学软件分析比较cmr3基因在腾冲嗜热厌氧杆菌和两种常温菌中编码氨基酸的基本理化性质和蛋白三级结构。结果显示,腾冲嗜热厌氧杆菌Cmr3蛋白在大肠杆菌中表达,分子质量为43.4 kDa;生物信息学分析发现,腾冲嗜热厌氧杆菌cmr3基因序列长1134 bp,共编码377个氨基酸,Cmr3蛋白具有亲水性,且与常温菌相比更具有热稳定性,蛋白三级结构更为紧凑。本研究可以为了解嗜热菌CRISPR-Cas系统在嗜热过程中的作用提供科学依据。

腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4基因的表达及生物信息学分析

腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)cmr4基因是CRISPR-CasⅣ-B亚型原核防御系统的一部分。为研究其在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,通过PCR技术扩增得到cmr4基因,构建原核表达载体pET-28a::cmr4并在大肠杆菌BL21中表达Cmr4蛋白;同时利用生物信息学软件分析腾冲嗜热厌氧杆菌、布氏酸菌以及肉毒杆菌中cmr4所编码氨基酸的理化性质。成功构建了原核表达载体pET-28a::cmr4,腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4基因并在大肠杆菌BL21中得到表达,Cmr4蛋白其分子质量为40 kD,以可溶形式存在。实时荧光定量PCR结果表明腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4 mRNA在75℃和80℃高表达;生物信息学分析显示腾冲嗜热厌氧杆菌cmr4基因编码349个氨基酸,Cmr4为亲水性蛋白,等电点为5.19,不存在糖基化位点,潜在的磷酸化位点有29个。本研究结果对Cmr4在嗜热菌中热适应作用机制的研究有一定的参考价值。

嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究

以乙醇产量和细胞密度的提高为目标,从碳源和氮源入手,对嗜热厌氧产乙醇杆菌Therm oanaerobact-er ethanolicusJW 200的培养基作了初步优化以提高乙醇代谢途径中的关键酶的得率,便于提纯.葡萄糖浓度的提高对乙醇的产生有明显的诱导作用,但当葡萄糖浓度高于2%,乙醇产量反而下降.酵母粉对乙醇产量没有促进作用,单纯提高酵母粉浓度对细胞密度无显著影响,而同时提高葡萄糖和酵母粉浓度至2.0%,OD600最高可达2.0.2%葡萄糖,0.5%酵母粉对单位细胞乙醇产量的诱导效果最佳.T.ethanolicusJW 200粗酶液中未检测到丙酮酸脱羧酶的活性,经亲和柱C ibacron B lue-3GA部分纯化,在NAD洗脱蛋白中检测到辅酶A依赖型乙醛脱氢酶的活性,表明辅酶A依赖型乙醛脱氢酶是该菌乙醇代谢途径中的关键酶,它和乙醇脱氢酶共同作用,将乙酰辅酶A转化成乙醇.

嗜热厌氧杆菌热稳定CRISPR/Cas9基因组编辑技术及在细胞工厂构建中的应用研究进展

嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)来源的菌株作为一个高温发酵的细胞工厂,具有生产生物燃料和化学品的潜力,已引起了研究者的广泛兴趣。随着嗜热厌氧杆菌属来源的多个菌株全基因组测序的完成以及相关的生理生化实验的开展,建立一个简便、快捷的基因操作技术将有助于进一步深入理解和认识嗜热厌氧杆菌有关的代谢途径。最近,成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas)的基因编辑技术在嗜热菌中被开发应用。文中综述了嗜热厌氧杆菌的研究进展和热稳定性CRISPR/Cas9基因组编辑技术在嗜热厌氧杆菌的发展和建立,并对该编辑技术在其他嗜热菌未来发展的趋势提出参考意见。嗜热菌热稳定性的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立和完善不仅可以促进嗜热菌遗传改造技术的发展,而且有助于提高嗜热菌遗传育种和代谢工程改造的效率。

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。

响应面法优化嗜热厌氧代谢工程菌发酵产乙醇的培养基

利用响应面法优化嗜热厌氧代谢工程菌产乙醇的培养基,在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman设计对影响嗜热厌氧代谢工程菌发酵产乙醇的重要培养基组分进行了筛选,确定主要影响因子为葡萄糖、木糖和酵母提取物。再用最陡爬坡实验逼近最大响应区域。最后用中心组合设计和响应面分析法,确定了主要影响因子的浓度。优化后的培养基组成为葡萄糖13.07g/L,木糖9.58g/L,酵母提取物3.78g/L,其他组分浓度同MTC培养基,不添加一水半胱氨酸盐酸盐和二盐酸吡哆氨。在此培养基条件下,乙醇产量和乙醇得率分别为(6.102±0.21)g/L和(0.38±0.012)g/g,是优化前产量的1.46倍。

一株厌氧嗜热杆菌生长及发酵特性的初步研究

论文对筛选并鉴定为Thermoanaerobacterium saccharolyticum菌株的生长、底物利用情况、产物生成以及酒精耐受性进行了研究。结果表明,该菌在以甘露糖、葡萄糖和木糖为碳源时生长较好,同时能够较好的利用木聚糖和木薯淀粉;最适底物浓度为15g/L;不同的葡萄糖:木糖比例对其生长无显著影响;能耐受的培养基最高初始酒精浓度为3%(V/V)。在5g/L的木聚糖、木糖和木薯淀粉培养基中发酵60h后,产物主要有乙醇、乳酸和乙酸,乙醇产量分别为0.824、0.867和0.916g/L。

嗜热厌氧芽孢杆菌偶氮还原酶蛋白结构模拟分析及原核表达条件优化

嗜热厌氧芽孢杆菌PDR2(Anoxybacillus sp. PDR2)是一株极具潜力的偶氮染料降解菌,但目前对一种菌株中分离纯化两种具有不同催化活性的偶氮还原酶的相关研究还未见报道.从具有降解偶氮染料活性的嗜热厌氧芽孢杆菌的全基因组序列中,获得两种偶氮还原酶基因,将其命名为FMN和AZO,两种蛋白不具亲缘关系,但蛋白结构均属于α/β型结构.两种蛋白结构中的配体FMN可能为蛋白与底物结合提供电子和质子,且配体结构中异咯嗪环分子的关键原子N5分别与蛋白的Asn104和His75形成氢键,在稳定配体和蛋白活性可能起到重要作用,可作为研究蛋白与底物结合特异性的关键氨基酸.此外,采用原核表达技术成功将两种基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中表达.优化两种重组菌的诱导表达条件,AZO重组菌最佳诱导条件为添加诱导剂时菌体量OD600为0.8、诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导时间24 h及诱导温度16℃,此时胞内重组酶降解甲基红的比酶活达到15.65 U/mg;FMN重组菌最佳诱导条件为添加诱导剂时菌体量OD600为0.8、诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间10 h及诱导温度20℃,此时胞内重组酶降解甲基红的比酶活达到18.66 U/mg.本研究表明优化两种偶氮还原酶原核表达条件能够显著提高酶活性,结合其蛋白结构特性可为后续蛋白纯化及分析蛋白质与底物结合特异性提供理论基础.(图11表1参33)

一种高温细菌葡聚糖磷酸化酶基因的克隆与表达

葡聚糖磷酸化酶(GlgP)在生物体的糖代谢过程中具有中心地位的作用。腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermo-anaerobacter tengcongensis MB4T=AS.1.2430T=JCM11007T)分离自云南腾冲的温泉,其最适生长温度为75℃。为研究腾冲嗜热厌氧杆菌的葡聚糖磷酸化酶(Tte-GlgP)的性质,试验以T.tengcongensis MB4T的全基因组为模板,通过PCR扩增得到MB4T中的编码GlgP的基因(glgp),将其克隆到表达载体pET23b上,经过PCR验证、酶切验证和测序验证正确后,转化到宿主细胞大肠杆菌BL21DE3中,成功得到了表达。通过SDS-PAGE电泳分析得到其分子量约为64ku,与预期的结果一致。试验为Tte-GlgP性质的进一步研究和应用构建了基因工程菌株。