应用国产石蜡进行热启动PCR研究

应用国产石蜡进行热启动ＰＣＲ研究湖南医科大学肿瘤研究所（４１００７８）易红，胡维新，姚开泰本文报道了使用国产切片石蜡进行热启动ＰＬＲ研究，对人基因组中Ｐ５３抑瘤基因ＤＮＡ进行扩增，并与常规ＰＣＲ进行了比较，从而显示热启动ＰＣＲ的优点。材料与方法１Ｔａ...

热启动PCR技术的研究进展

热启动PCR技术是通过各种物理化学方法控制PCR反应的必须组分来实现达到有效扩增特异性PCR产物的目的一种方法。该技术的问世解决了非特异性扩增产物的出现,引物二聚体的形成等问题。使单拷贝基因和超长片段的扩增更为简便。本文较系统的介绍了热启动PCR的原理和近几年的技术进展。

一种简便的热启动PCR方法扩增金葡菌nuc基因

本文采用低熔点琼脂糖包被Taq酶热启动聚合酶链式反应(PCR)扩增出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因,该法与普通PCR扩增效果无异且具有避免非特应性扩增等特点。同时研究了不同退火温度对扩增反应结果的影响,确定了51.7℃为最佳退火温度。为进一步研究热启动PCR方法提供了依据。

用热启动加两步改良PCR法探讨载脂蛋白E基因多态性与老年性骨质疏松的关系

目的探索ApoE基因的优化扩增方法及ApoE基因多态性与老年人骨质疏松之间的关系。方法分别用常规PCR法和热启动加两步PCR法,对ApoE基因进行扩增,对比两种方法的扩增效果。收集60岁以上老年骨质疏松组和正常对照组患者血样各100份,采用热启动加两步PCR法对ApoE扩增产物进行测序,将测序结果与GENBANK中ApoE目的片段序列比对结果并分析ApoE基因多态性对骨质疏松影响。结果采用热启动加两步循环法优化ApoE的扩增方法,可以有效提高ApoE的PCR扩增的产率并可减少非特异性扩增。骨质疏松组E4等位基因频率高于对照组(P<0.05)。结论热启动加两步循环法可以有效地优化ApoE的扩增效率和特异性,ApoE4等位基因与老年性骨质疏松可能相关。

耐热Taq DNA聚合酶的酸酐修饰及其在降低PCR非特异性扩增中的应用评价

酸酐能与聚合酶上的赖氨酸结合形成聚合物,试验通过选用合适的酸酐,修饰TaqDNA聚合酶。在常温下,酶活性被封闭,升温过程中不表现酶活,从而减少非特异性扩增和引物二聚体的形成;而在较高的温度下一段时间后,一般为94℃、15 min,酸酐脱落,聚合酶得以恢复正常的扩增活性,从而实现PCR反应的热启动。由此建立的热启动PCR体系灵敏度高,可以检测到10个拷贝的DNA分子,较普通PCR体系提高了2个数量级。此方法较其他方法操作简单成本低廉,且所得的热启动TaqDNA聚合酶稳定性好,便于保存,其灵敏性与特异性也更高。这种通过化学修饰形成的复合物达到热启动PCR目的的方法的建立,具有着重要的意义,是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一。

DNA聚合酶适配子6-10提高定量PCR的特异性

目的利用DNA聚合酶适配子6-10进行热启动定量PCR,提高定量PCR的检测灵敏度。方法适配子6-10组、抗体对照组和非热启动对照组分别进行定量PCR,制作标准曲线,以复相关系数(r2)大于0.99为线性范围,比较其线性范围下限。结果非热启动定量PCR对人死亡受体5(death receptor 5,DR5)的检测线性范围下限为105拷贝/μl,而适配子6-10(200nmol/L)与抗DNA聚合酶抗体方法对DR5的检测线性范围下限为103拷贝/μl。熔解曲线分析表明,在扩增高浓度靶分子(105拷贝/μl)时,各种方法非特异扩增均不明显,没有形成非特异峰;在扩增低浓度靶分子(103拷贝/μl)时,非热启动对照组的非特异扩增明显,产生明显的非特异峰,而DNA聚合酶适配子6-10可以明显消除非特异扩增形成的非特异峰。结论DNA聚合酶适配子6-10可以提高定量PCR的检测灵敏度。

利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36的初步研究

通过优化PCR扩增体系,利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36。结果表明,利用扩增长片段的LA Taq酶,结合使用GC buffer I,以及热启动PCR技术和两步法扩增,在退火温度为62℃和62.8℃时,得到了扩增效率较高,特异性高的16.5kb目标带。

DNA聚合酶适配子Trnc A-30提高定量PCR检测死亡受体5（DRS）的灵敏度

目的利用DNA聚合酶适配子TrncA-30进行热启动，提高定量PCR检测死亡受体5（deathreceptor5，DR5）的灵敏度.方法TrncA-30组、抗体对照组和非热启动对照组分别进行定量PCR，制作标准曲线，以复相关系数（r^2）大于0．99为线性范围，比较其线性范围下限.结果非热启动定量PCR对DR5的检测线性范围下限为10^5copies/ul，而适配子TrncA-30对DR5的检测线性范围下限为10^3copies/ul，与DNA聚合酶抗体方法灵敏度相当.熔解曲线分析表明，在扩增高浓度靶分子（10^5copies/ul）时，各种方法的非特异扩增均不明显，没有形成明显的非特异峰;在扩增低浓度靶分子（10^3copies/ul）时，非热启动对照组特异扩增明显，产生明显的非特异峰，而DNA聚合酶适配子TrncA-30可以明显消除非特异扩增而形成的非特异峰，从而提高检测的灵敏度.结论DNA聚合酶适配子TrncA-30可以提高定量PCR的检测灵敏废.

Cloning of Hoxc8 Promoter in Mongolian Sheep by Thermal Asymmetric Interlaced PCR

[Objective] The research aimed toexplore the method to obtain Hoxc8 pro- moter of Mongolian Sheep. [Method] Thermal asymmetric interlaced PCR was used to amplify the promoter sequence of Hoxc8 inMongolian Sheep. [Result] The ob- tained sequence by usingthermal asymmetric interlaced PCRwas not ideal and the sequencing results were not matching to the known sequence. Though promoter se- quence of Hoxc8 in Mongolian Sheep was not obtained by thermal asymmetric in- terlaced PCR, but the results could provide references for the relevant studies in the future. [Conclusion] The research laid the foundation for further study on the methy- lation status Hoxc8 promoter in Mongolian Sheep.

去离子甲酰胺在脑腱黄瘤病基因诊断中的应用

目的探讨去离子甲酰胺在脑腱黄瘤病基因诊断中的应用价值,同时为高GC含量DNA片段的扩增提供方法上的参考。方法在反应体系中不含去离子甲酰胺以及去离子甲酰胺浓度为1%-10%的情况下采用热启动PCR扩增CYP27A1基因4个高GC含量的片段,然后进行琼脂糖凝胶电泳,再用Image J软件分析不同去离子甲酰胺浓度下目标条带的光强度值,比较差异,最后挑选特异性扩增产物测序分析。结果在不含去离子甲酰胺和去离子甲酰胺浓度为1%-6%的情况下,均扩增出目标片段;在不含去离子甲酰胺时,4个目标片段的扩增产物均存在非特异性带,而当去离子甲酰胺的浓度为4%-6%时,非特异性带消失。不同浓度(0-6%)条件下目标带的光强度值差异无统计学意义。特异性扩增产物经测序验证为目标片段。结论采用热启动PCR,同时向反应体系中添加去离子甲酰胺能有效扩增出高GC含量的DNA片段,并避免非特异性带的产生,但反应体系中去离子甲酰胺的浓度宜控制在4%-6%。这一方法不仅适用于脑腱黄瘤病的致病基因—CYP27A1基因的检测,也可用于其他富含GC的基因的检测。

小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠可溶性ST2基因并构建其真核表达载体。方法:从小鼠肥大细胞株P815中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠可溶性ST2基因全长编码区,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mST2,然后进行酶切鉴定和序列分析。结果:小鼠可溶性ST2基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠可溶性ST2基因的全长编码序列为1 011 bp,编码336个氨基酸。结论:用热启动PCR技术能方便、准确地获得目的基因片段。成功地克隆小鼠可溶性ST2基因并构建了其真核表达载体,为进一步进行小鼠可溶性ST2蛋白的表达和功能研究奠定了基础。

CAT基因突变热点区域的PCR扩增方法

目的探讨过氧化氢酶基因突变热点区域PCR扩增方法,提高PCR反应的特异性和灵敏度,有助于快速检测CAT基因相关疾病。方法从人静脉血液标本提取人血液基因组DNA,设计引物扩增特定的CAT基因片段,联合应用热启动PCR和降落PCR技术。结果建立了重复性好,分辨率高的PCR反应体系。结论建立了适用于CAT基因突变热点区域的PCR反应体系,有助于快速检测CAT基因相关疾病。

小鼠白细胞介素-33基因的克隆及序列分析

目的:克隆小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,并对其进行序列分析。方法:从BALB/c小鼠的脊髓组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1(+)载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mIL-33,然后进行酶切鉴定与序列分析。结果:小鼠IL-33基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠IL-33基因的全长编码序列为801 bp,编码266个氨基酸。结论:小鼠IL-33基因成功的克隆并构建了其真核表达载体,为进一步进行IL-33的表达与功能研究奠定了基础。