利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。

药材甲热激蛋白基因SpHsp60的克隆及温度胁迫下的表达

本研究采用RT-PCR技术克隆了药材甲热激蛋白60(Heat shock protein 60,Hsp60)基因的cDNA全长序列,命名为SpHsp60(GenBank登录号:KX778623).氨基酸序列分析表明SpHsp60具有Hsp60基因家族高度保守的基序,实时定量PCR技术检测了不同温度胁迫后该基因的表达量,结果表明:-5℃和0℃低温处理2h,药材甲成虫体内的SpHsp60的表达量均显著高于对照组,且42℃高温处理2h后的表达量也显著高于对照组.说明SpHSP60与药材甲应对极端温度胁迫相关.

持续热应激状态下肉鸡心脏和肾脏组织损伤与hsp_(60) mRNA转录

为研究环境胁迫条件下热休克蛋白60 mRNA(hsp60mRNA)转录水平和应激性损伤的关系,将30日龄AA肉鸡的饲养环境温度从(22±1)℃突然升高到(37±1)℃分别热应激1、2、3、5和10 h后剖杀,利用临床血液病理学、组织病理学和荧光定量PCR方法,观察热应激不同时间对肉鸡重要器官心脏和肾脏组织损伤及其hsp60mRNA表达水平的影响。结果显示,持续热应激处理后的肉鸡血液肌酸激酶(CK)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)均显著升高,CK在2、3、5和10 h与对照组(无热应激)差异极显著(P<0.01),ALT在3 h与对照组差异显著(P<0.05),在5 h和10 h差异极显著(P<0.01);持续热应激处理2 h后的肉鸡心脏和肾脏组织均呈现出不同程度的以颗粒变性和水泡变性为主要特征的病理性损伤;心脏和肾脏组织中hsp60mRNA转录水平在热应激2 h时显著高于对照组(P<0.05),而在5、10h逐渐恢复正常。提示:hsp60mRNA转录水平与其相应蛋白的表达和肉鸡组织的热应激损伤存在一定程度的关联性。

热休克蛋白60基因多态性与噪声性听力损失易感性的关系

目的探讨热休克蛋白60(HSP60)基因多态性与噪声性听力损失的关系。方法采用横断面流行病学研究方法,对194名噪声暴露作业工人进行调查和听力测试,按听力学评价的结果将其分为听力损失组和听力正常组;用等位基因特异扩增法(ASA)和多聚酶链反应-限制性片断长度多态性法(PCR-RFLP)检测其HSP60基因上rs11551350和rs2340690两个单核苷酸位点的多态性。结果rs11551350位点在93名噪声性听力损失的工人中GG、AA和AG基因型的频率分别为1.1%、9.7%和89.2%,等位基因G和A的频率为45.7%和54.3%;在101名听力正常的工人中,基因型频率分别为5.9%(GG)、5.9%(AA)和88.1%(AG),等位基因频率为50.0%(G)和50.0%(A)。rs2340690位点在噪声性听力损失组CC、TT和CT基因型的频率分别为51.6%、7.5%和40.9%,等位基因C和T的频率为72.0%和28.0%;在听力正常组的基因型频率分别为45.5%(CC)、4.0%(TT)和50.5%(CT);等位基因频率为70.8%(C)和29.2%(T)。两位点的基因型分布及其等位基因频率在噪声性听力损失组与听力正常组之间差异均无显著性(P>0.05)。采用多元Logistic回归对两组间年龄、性别、吸烟状况、爆震史和累积噪声暴露量等因素进行校正后,未发现两位点中任一基因型的噪声性听力损失的危险度有显著性升高(P>0.05)。结论HSP60基因的rs11551350和rs2340690两个单核苷酸位点的多态性可能不是噪声性听力损失的遗传易感性因素。

唐鱼热休克蛋白60基因cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE技术,成功克隆了唐鱼(Tanichthys albonubes)热休克蛋白60基因cDNA全长序列,命名为TaHSP60(GenBank登录号:HM234132)。研究表明:该基因序列全长为2 486bp,5'端非翻译区(URT)102bp,3'URT 656bp,开放阅读框(ORF)1 728bp,编码575个氨基酸。序列比对分析表明唐鱼HSP60与斑马鱼(Danio rerio)的相似性高达96.2%,与鲫(Carassius auratus)、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大西洋鲑(Salmo salar)以及非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)的相似性分别为93.2%、89.7%、88.3%和83.8%。Clustal X比对结果表明:该序列含有典型的mt-HSP60特征序列、ATP结合位点,以及C末端保守的重复区域GGM。进化分析结果表明,唐鱼HSP60与斑马鱼HSP60聚为一支,二者亲缘关系较近。荧光定量PCR显示唐鱼HSP60的mRNA在肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道和脑等8种组织中均有表达,其中肝脏中表达量最高,而在鳃和鳍条呈微量表达。统计分析表明,其他各组织与肝脏相比均有显著差异。铜暴露后,唐鱼肝脏HSP70mRNA表达水平分别在48h和96h出现上调,均显著高于对照组。

热休克蛋白60对热应激H 9C 2心肌细胞凋亡的影响及机理研究

[目的]观察热应激过程中胞外热休克蛋白60(Hsp60)对H9C2大鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。[方法]将H9C2心肌细胞随机分为热应激0 h、1 h、2 h和4 h四组,对其进行相应时间的热应激处理,通过流式细胞仪检测H9C2心肌细胞的凋亡情况;将H9C2心肌细胞随机分为对照组和热应激组,热应激组心肌细胞进行2 h的热应激处理,通过ELISA方法检测细胞培养上清液中Hsp60的含量;将H9C2心肌细胞随机分为anti-Hsp60(-)和anti-Hsp60(+)两组,在培养基中分别加入等量的山羊抗鼠IgG和Hsp60抗体,0.5 h后,对其进行2 h的热应激处理,通过流式细胞术和荧光定量PCR检测H9C2心肌细胞的凋亡情况;在anti-Hsp60(-)和anti-Hsp60(+)的基础上,将p38、ERK和JNK的抑制剂SB203580、PD98059、SP600125分别加入细胞培养上清液,通过Western Blotting技术检测H9C2心肌细胞p-p38/p38,p-ERK/ERK,p-JNK/JNK的变化。[结果]随着热应激时间的延长,H9C2心肌细胞的凋亡率显著升高;热应激导致细胞培养上清液中Hsp60显著升高;与anti-Hsp60(-)组相比,anti-Hsp60(+)组心肌细胞的凋亡率显著升高,p-ERK/ERK比值显著降低,p-JNK/JNK比值显著升高。加入SB203580、PD98059、SP600125后,anti-Hsp60(+)组细胞凋亡率分别表现为无显著差异,显著降低,显著升高。[结论]细胞外微量的Hsp60可缓解热应激导致的H9C2大鼠心肌细胞凋亡,其机制与ERK、JNK的激活有关。

噪声作业工人血浆热应激蛋白60抗体与心电图异常的关系研究

目的 探讨噪声作业工人血浆热应激蛋白 (HSP) 6 0抗体与心电图异常之间的关系。方法 用Westernblot免疫印迹法测定噪声作业工人血浆HSP 6 0抗体水平。用多因素Logistic回归分析HSP 6 0抗体水平与心电图异常的关系。结果 心电图异常组噪声作业工人HSP6 0抗体阳性率为 15 4 % ,心电图正常组为 5 9% ,差别有显著性意义(P <0 0 1) ;在排除了常见心血管疾病危险因素的影响后 ,心电图异常与HSP6 0抗体之间仍然存在着较强联系。结论 血浆HSP6 0抗体可能是噪声作业工人心电图异常的危险因素。

热休克蛋白60基因多态性和抗体水平及其与冠心病的关系

目的探讨热休克蛋白60(Hsp60)基因多态性和抗体水平及其与冠心病(CHD)的关系。方法采用病例对照研究,选取未治疗过的CHD患者615例,对照以年龄(±1)岁和性别以1∶1与CHD组匹配共选取615例。采用间接酶联免疫吸附法测定血浆Hsp60抗体水平;TaqM an-MGB探针检测hsp60基因上rs2340690、rs788016、rs2565163和rs2305560四个单核苷酸位点的多态性(SNPs)。结果CHD组的Hsp60抗体水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。上述4个SNPs的基因型频率在CHD组和对照组之间差异均无统计学意义,采用多元Lo-gistic回归分析,对年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压史、糖尿病史和家族CHD史等因素进行校正后,未发现4个SNPs的任一基因型与CHD的危险度有关联;多因素协方差分析校正了以上混杂因素后,CHD组和对照组hsp60基因4个SNPs不同基因型之间的血浆Hsp60抗体水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Hsp60抗体可能与CHD发病有关,hsp60基因的多态性和抗体水平与CHD风险均没有显著性关系。

热应激蛋白60与儿童特发性血小板减少性紫癜

目的 研究特发性血小板减少性紫癜 (ITP)患儿热应激蛋白 6 0 (HSP 6 0 )水平 ,探讨HSP 6 0在ITP发生、发展中的可能作用。方法 用Westernblot法检测了 2 9例ITP患儿和 30名正常儿童外周血淋巴细胞HSP 6 0水平。结果 对照组 30名儿童均检测出HSP 6 0 ,而 2 9名ITP患儿中仅有 1人检测到HSP 6 0 ,两者具有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 HSP 6 0与ITP的发生可能相关 。

电离辐射对人肝细胞子代克隆热休克蛋白HSP60表达的影响

采用激光共聚焦显微技术和Western blot技术观察热休克蛋白60(HSP60)在受照人肝细胞克隆子代中的表达情况,并对其在不同受照剂量组中的表达量进行分析,探讨辐射对人肝细胞克隆子代HSP60蛋白表达的影响。结果显示HSP60蛋白主要集中于细胞核的周围,荧光定量分析结果表明HSP60蛋白表达量随着照射剂量的增加出现上调趋势。Western blot测定结果显示各剂量照射组克隆子代中HSP60蛋白随照射剂量的增加而表达增强,该结果与激光共聚焦显微观察结果一致。上述结果表明辐射可使受照人肝细胞子代中的HSP60蛋白表达发生改变,该结果可为探讨辐射诱发基因组不稳定性潜在的分子机理提供基础资料。

冠心病类型与热休克蛋白60水平及肝脂肪酶基因多态性的关联研究

目的:探讨血清热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)水平及肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene,LIPC)NlaⅢ酶切位点多态性与冠心病(coronary heart disease,CHD)类型之间关系。方法:取91例冠心病患者和72名健康对照者空腹晨起静脉血,从全血中抽提基因组DNA,采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析LIPC多态性在中国汉族冠心病人群中的发生频率和基因型分布。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清HSP60水平。结果:(1)冠心病与正常对照组比较TT纯合子基因型频率为15.4%对8.3%,差异无显著性意义(P=0.373)。亚组分析中,心肌梗死与健康对照组28.1%对8.3%,差异有显著性意义(P=0.023)。(2)TT、CT、CC基因型冠心病各组HSP60水平中分别为(6626±2621)、(3980±3578)、(3537±3018)pg/ml,TT基因型与CT、CC两种基因型之间HSP60水平差异有显著性意义(P<0.05)。(3)冠心病组中HSP60<3639pg/ml组TT纯合子占2.2%,心肌梗死占2.2%;而>3639pg/ml组中TT纯合子占28.9%,心肌梗死占68.9%,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:LIPCNlaⅢ多态性随着血清HSP60升高,TT纯合子出现频率增大,严重的冠脉事件发生几率增加。

噪声作业工人血浆热应激蛋白60抗体与高血压的关系研究

目的探讨噪声作业工人血浆热应激蛋白(HSP)60抗体与高血压之间的关系。方法用Westernblot免疫印迹法测定噪声作业工人血浆HSP60抗体水平。用多因素Logistic回归模型分析HSP60抗体水平与高血压的关系。结果高血压组调查对象HSP60抗体阳性率为13·86%,血压正常组为6·55%,差别有显著性意义(P<0·05);在排除了常见高血压病危险因素的影响后,高血压与HSP60抗体之间仍然存在着较强联系(P<0·05)。结论血浆HSP60抗体可能是噪声作业工人高血压的危险因素。

热应激对猪睾丸Hsp60和Hsp90表达与定位的影响

建立了环境热应激和睾丸局部热处理猪动物模型,用qRT-PCR和Western blot法检测了热休克蛋白家族成员Hsp60和Hsp90 mRNA和蛋白表达水平的变化,用免疫组织化学方法检测Hsp60和Hsp90在猪睾丸的组织细胞学定位。qRT-PCR和Western blot结果显示,与对照组相比,环境热应激组和局部睾丸热应激组Hsp60和Hsp90 mRNA和蛋白的表达量均显著升高。免疫组织化学结果显示,对照组Hsp60主要表达在精母细胞和支持细胞的细胞质,环境热应激组和局部睾丸热应激组Hsp60免疫阳性从精母细胞的细胞质转移至精原细胞的细胞核。热处理前后Hsp90定位于精原细胞和长形精子细胞。环境高温热应激和局部睾丸热刺激导致Hsp60和Hsp90表达升高,提示Hsp60和Hsp90在热应激猪睾丸精子发生过程中发挥重要作用。

翘嘴红鲌热休克蛋白60的基因克隆及其表达特征分析(英文)

利用同源克隆和RACE技术克隆了翘嘴红鲌热休克蛋白HSP60 cDNA全长序列,并对HSP60基因的序列特征进行了分析。EiHSP60 cDNA序列长2 323 bp,开放阅读框为1 728 bp,编码575个氨基酸,其编码蛋白相对分子量为61.26 k D,等电点为5.27。BLAST分析结果表明EiHSP60与哺乳动物、鸟和鱼类等物种的CCT具有较高的同源性。生物信息学分析结果显示,EiHSP60蛋白序列中包含1个典型的分子伴侣蛋白60信号基序。实时荧光定量PCR检测结果显示,EiHSP60在翘嘴红鲌各个组织中均有表达,但在肝脏中的表达量为最高。使用脂多糖对翘嘴红鲌进行攻毒后,在不同时间段取其肝脏总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行EiHSP60 m RNA的表达水平分析。分析结果显示,经过脂多糖攻毒后翘嘴红鲌HSP60呈现时间依赖型的表达模式,且在肝脏中的表达水平呈现上调趋势。上述结果表明,EiHSP60为一种涉及免疫反应的诱导型蛋白,而高表达量的EiHSP60可能在提高翘嘴红鲌免疫反应过程中发挥重要作用。

敲低膀胱癌细胞热休克蛋白60(HSP60)通过上调乳酸脱氢酶A(LDHA)表达抑制人NKL细胞杀伤

目的探索热休克蛋白60(HSP60)蛋白表达变化影响膀胱癌细胞逃避自然杀伤(NK)细胞免疫监视的作用及机制。方法免疫组织化学染色法检测HSP60在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达,统计学分析HSP60在膀胱癌及癌旁组织的表达差异及HSP60表达水平与膀胱癌患者预后的相关性。利用腺病毒载体构建HSP60稳定干涉及过表达的膀胱癌细胞系并与NKL细胞共培养,ELISA及LDH释放实验检测NK细胞活化及杀伤能力的变化。Western blot法检测膀胱癌细胞乳酸脱氢酶A(LDHA)表达,试剂盒检测乳酸分泌。在HSP60稳定干涉及过表达的膀胱癌细胞系,利用小干涉RNA(siRNA)敲低或利用质粒过表达膀胱癌细胞中的LDHA,检测对NKL细胞杀伤能力的影响。利用线粒体活性氧探针MitoSOX检测线粒体活性氧(ROS)水平,Western blot法检测膀胱癌细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的蛋白表达,利用靶向线粒体抗氧化剂MitoEMPO及siRNA降低HSP60稳定干涉膀胱癌细胞中线粒体ROS及HIF-1α水平,探索HSP60表达降低促进LDHA表达的具体机制。结果膀胱癌组织HSP60蛋白的表达水平较癌旁组织显著降低,且HSP60表达越低的膀胱癌患者其预后越差;敲低HSP60蛋白表达可显著上调膀胱癌细胞LDHA的表达及乳酸的分泌,反之,过表达HSP60可显著抑制膀胱癌细胞LDHA的表达及乳酸的分泌;siRNA LDHA可显著增强HSP60敲低导致NKL细胞的杀伤抑制,同时过表达LDHA可显著抑制HSP60过表达导致NKL杀伤增强。此外,敲低膀胱癌细胞HSP60表达可通过激活ROS/HIF-1α通路促进LDHA的表达。结论敲低膀胱癌细胞HSP60表达通过激活ROS/HIF-1α通路促进LDHA的表达,抑制NK细胞的杀伤作用。

注射黄芪多糖对吉富罗非鱼热应激蛋白基因表达的影响

将黄芪多糖(APS)用无菌生理盐水配制成2 mg/mL(低剂量)、20 mg/mL(高剂量)两种针剂,腹腔注射吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)。分别在注射后0 h、24 h、48 h、72 h和96 h采样提取吉富罗非鱼鳃、头肾、肝脏和脾脏组织中的总RNA,并反转录成cDNA,利用Real-time PCR方法对不同组织中的热应激蛋白(hsp70)基因表达进行定量分析。结果显示,在24 h时,高剂量组吉富罗非鱼鳃、头肾和肝脏三个组织中hsp70基因的表达量显著高于同期对照组(P<0.05),之后表达量快速降低,低剂量组hsp70基因表达量仅在脾脏中有上调。实验表明,APS可通过诱导吉富罗非鱼hsp70基因表达来保护免疫细胞免受应激损伤,从而增强鱼体抵抗病原菌的能力。

热应激绍兴鸭不同组织HSP70基因mRNA表达研究

研究蛋鸭热应激条件下不同组织中热休克蛋白70(HSP70)基因mRNA表达规律,为揭示蛋鸭热应激反应机理提供参考。60只绍兴蛋鸭25℃饲养20d,其中30只进行40℃热应激处理1h,采取荧光定量PCR方法分别测定不同组织中HSP70mRNA的表达水平。试验组与对照组相比,肝脏、脾脏和胰腺组织HSP70mRNA表达差异不显著,其他6种组织HSP70基因表达量均有不同程度的增加,试验组心脏、腿肌、垂体、下丘脑、胸肌、肾脏中HSP70基因表达量分别高于对照组3.6倍、2.8倍、2.7倍、2.4倍、2.2倍和1.57倍。

小续命汤对急性脑缺血再灌注线粒体相关蛋白Hsp60、Mitofilin表达的影响

目的:观察小续命汤对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及对线粒体相关蛋白表达的影响。方法:60只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、小续命汤组、环孢素A组、溶媒组5组,每组12只。采用大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型,观察各组大鼠的一般情况、神经功能缺损,采用Nissl染色观察神经细胞损伤,Western blot和免疫组织化学法检测脑缺血再灌注后缺血半暗带皮层线粒体热休克蛋白60 (Heat shock protein 60,Hsp60)和mitofilin蛋白的表达。结果:与假手术组比较,模型组出现明显神经功能缺损,细胞发生缺血再灌注损伤,缺血半暗带皮层Hsp60、mitofilin蛋白的表达上调(P <0.05)。与模型组比较,小续命汤组、环孢素A组可显著改善大鼠神经功能缺损评分,减轻神经细胞的缺血再灌注损伤,并显著上调脑缺血半暗带皮层Hsp60、mitofilin蛋白的表达,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论:小续命汤可改善大鼠神经功能缺损评分,减轻神经细胞的缺血再灌注损伤,上调脑缺血半暗带皮层Hsp60、Mitofilin蛋白的表达,从而发挥脑保护的作用。