金银花连翘提取物对大肠杆菌热敏肠毒素的拮抗作用

应用兔回肠结扎试验研究了金银花连翘提取物对大肠杆菌热敏肠毒素（ＬＴ）致肠分泌的拮抗作用。实验的结果表明，金银花连翘提取物对大肠杆菌致病作用的影响至少涉及到抑菌和对热敏肠毒素的拮抗作用两个方面，且其作用随提取物浓度增高而增强。

应用PCR技术扩增大肠杆菌热敏肠毒素基因

以一对合成的特异性寡核苷酸片段为引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），对不同血清型的ＥＴＥＣ以及１０４份牛、猪及鸡源大肠杆菌分离物中ＬＴ基因片段进行扩增。３株已知血清型ＥＴＥＣ、１３份牛源、６份鸡源、１０份猪源的大肠杆菌扩增后可见一条３１４ｂｐ的片段，而非ＥＴＥＣ大肠杆菌、沙门氏菌等扩增后未出现这一片段。扩增产物用ＳｍａＩ酶解为１９０ｂｐ和１２４ｂｐ两个片段。印迹杂交表明，３１４ｂｐ扩增片段及ＳｍａＩ酶解的１２４ｂｐ和１９０ｂｐ片段均能与特异的ＬＴＢ基因探针杂交，Ｄｏｔ－印迹杂交与ＰＣＲ对样品的扩增结果相一致。

猪源性大肠埃希氏菌血清型及热敏肠毒素的研究

业已确诊，甘肃省许多地区未断奶仔猪腹泻的主要病原是大肠埃希氏菌。由于大肠埃希氏菌血清型繁多，使本病的防制受到一定的区域性限制，亦由于该菌产生的热敏肠毒素（ＬＴ）在致腹泻中起重要作用，具有抗原性，因此进一步研究大肠埃希氏菌的血清型和ＬＴ，筛选强致病性的...

大肠杆菌热敏肠毒素的检测及纯化

采用平板免疫溶血试验、兔回肠结扎试验,探讨了大肠杆菌耐热肠毒素制备的方法和检测方法。试验表明:平板免疫溶血试验能够快速灵敏地检测出热敏感肠毒素,并具有很强的特异性,比肠结扎试验灵敏度高,而且简便易行;试验将细菌接种到产毒素培养基上培养,进行增菌,然后离心取上清液,沉淀溶于PBS液中用多黏菌素B浸出,均用80%饱和度的(NH4)2SO4盐析,之后用SephadexG-100凝胶层析分离纯化,最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测热敏肠毒素的纯度。

猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体 (pro ST)和LT的B亚单位 (LTB)成熟多肽的序列 ,再通过套式PCR将pro ST编码序列 3′端和LTB编码序列 5′端融合 ,并置于同一阅读框内 ,得到ST和LTB的融合基因 ,将此序列克隆到pGEM T质粒中 ,序列分析后 ,亚克隆到表达载体pQE30中 ,在大肠杆菌细胞中得到表达 ,表达的融合蛋白同时具有ST和LTB的抗原性 ,且无ST和LT的生物毒性。

热敏肠毒素促进产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附的初步研究

本试验利用PCR技术,以K88ac标准株C83902基因组DNA为模板扩增出热敏肠毒素(heat-labile toxins,LT)基因,大小约1.1 kb。将其克隆入表达质粒载体pACYC184,构建和筛选出含正确插入LT基因的pACYC-LT重组质粒。采用同样方法,构建和筛选出两种含点突变LT基因的重组质粒(pACYC-LT72和pACYC-LT192)。进一步将上述重组质粒DNA转化入不表达任何毒素的大肠杆菌SE5000株。GM1-ELISA结果表明,上述重组菌均能在体外正常表达LT毒素蛋白。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,比较了表达和不表达LT的细菌对细胞黏附性能。数据表明,LT的表达使细菌对肠上皮细胞的黏附效应明显增加(12.3±3.4倍)。两种LT毒素蛋白的单氨基酸突变体的表达证明了LT毒素的ADP核糖基化作用对其增强致病菌对肠细胞的黏附作用是必要的。蛋白激酶A的抑制剂Rp-cAMP、腺苷酸环化酶的抑制剂DDA和LT毒素的受体GM1都可阻断LT毒素对细菌黏附性能的提升作用。

电针对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用

The antagonistic effect of electroacupuncture on intestinal secretions of liquid and dielectrics mediated by Escherichia coli(E.coli) heatlabile enterotoxin (LT) were studied in the ligated rabbit ileum.The results showed that electroacupuncture at Houhai and Baihui acupoints markedly declined the retention of liquid and the net secretion of sodium ion induced by LT in loops (P<001 and P<005 respectively).

大肠杆菌热敏肠毒素对仔猪病理及生理学指标的影响

本试验旨在构建仔猪产热敏肠毒素大肠杆菌模型和热敏肠毒素模型,观察各组的病变情况,并检测相关生理生化指标和病理指标来进行对比分析。通过产热敏肠毒素大肠杆菌灌胃以及热敏肠毒素腹腔注射的方法建立2种仔猪腹泻模型;观察各组的病变情况,检测仔猪模型生理生化、病理指标。结果显示:2个试验组在试验期间与空白组相比较平均日增重均呈现负增长,白细胞和中性粒细胞数显著升高(P<0.05),淋巴细胞数显著降低(P<0.05);剖检可见肺实变严重,肠系膜淋巴结肿胀,肠腔积液;病理组织学检查发现,各试验组小肠肠壁变薄,肠绒毛脱落变短,杯状细胞增多;免疫组化结果显示,空肠组织中有热敏肠毒素存在。试验结果对比分析表明,毒素组与细菌组具有相似的症状表现与指标类型;热敏肠毒素可能为产热敏肠毒素大肠杆菌病的直接致病因子。

大肠杆菌热敏肠毒素对猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力及细胞因子表达的影响

本试验旨在探究大肠杆菌热敏肠毒素处理(heat labile enterotoxin,LT)后,猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力及细胞因子ET-1、IL-1β水平的变化。首先采用D-半乳糖凝胶树脂层析法提取猪E coli LT,利用SDS-PAGE验证蛋白纯度,并用Vero细胞检验提取物的生物学活性,最后采用CCK-8法检测LT对猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力的剂量时间效应,ELISA法检测细胞培养上清中ET-1、IL-1β水平的变化。结果表明:所提蛋白为AB_5结构的LT,且具有良好的生物学活性;0.01 mg/L的提取蛋白作用3 h后便可显著降低小肠黏膜微血管内皮细胞的活性(P<0.05);作用细胞6 h后,0.01,0.1和10 mg/L LT组细胞培养上清中ET-1的含量显著升高(P<0.05),0.01和1 mg/LLT组IL-1β的含量显著升高(P<0.05)。结果表明,E coli LT可以显著改变猪小肠黏膜微血管内皮细胞的活力及细胞因子的表达。

大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基研究进展

产肠毒素大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coil,ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC产生两类肠毒素,一种是对热敏感的热敏性肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT),另一种是对热不敏感的耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)。LT不仅是ETEC主要的毒力因子,而且还是一种重要的黏膜佐剂,它由A、B亚基组成,由于LT A具有毒性作用,限制了LT作为黏膜免疫佐剂的应用;而LT B无毒且具有黏膜佐剂活性,使其成为备受关注的佐剂之一。近年来对LT B的结构、介导的免疫调节分子机制、突变体及其佐剂作用已进行了较为深入的研究,为充分利用LT B的黏膜免疫佐剂功能奠定了基础。

大肠杆菌热敏性肠毒素研究进展

大肠杆菌肠毒素是引起腹泻的主要致病因子,可以分为热敏性肠毒素和耐热性肠毒素两类。本文就热敏性肠毒素的理化性质、分子结构和生物学功能、免疫原性、免疫佐剂作用以及国内外对其免疫原性与佐剂效应的应用研究进行了综述。

大肠杆菌热敏性肠毒素综述

大肠杆菌肠毒素是引起腹泻的主要致病因子,可以分为热敏性肠毒素和耐热性肠毒素两类[1]。本文就热敏性肠毒素的理化性质、分子结构和生物学功能、免疫原性、免疫佐剂作用以及国内外对其免疫原性与佐剂效应的应用研究进行了综述。

一株牛源产不耐热肠毒素大肠杆菌的分离鉴定

从遵义犊牛腹泻粪便中分离到一株大肠杆菌ZB9,通过微生物生理生化、Southern分析、PCR检测、免疫学及生物学毒性检测,鉴定为产LT的大肠杆菌,分析表明,该株菌与猪源、人源等产LT的大肠杆菌具有一定相似性。

肠毒素大肠杆菌LT—B基因转基因马铃薯口服免疫原性研究

探讨马铃薯表达的产肠毒素大肠杆菌热敏肠毒素B亚基口服免疫原性,选择4周龄的昆明白小鼠。转基因马铃薯块茎经冷冻干燥后,研磨成粉状,以灌胃给药的方式对小鼠进行免疫。分0.2 g、0.4 g和0.6 g三个剂量组,免疫三次,每周一次。对照组用5μg细菌中表达的抗原蛋白腹腔注射免疫小鼠,空白组小鼠饲喂普通鼠粮。利用ELISA方法对小鼠血清、粪便特异性抗体表达进行分析。结果有45%小鼠经转基因马铃薯口服免疫后可诱导特异性的免疫应答。与细菌表达的抗原免疫反应相比,血清IgG反应和黏膜sIgA反应略强或相当。说明产肠毒素大肠杆菌转基因植物疫苗免疫动物可诱导特异的系统免疫应答和黏膜免疫应答。为利用植物生产预防大肠杆菌性腹泻可食用的口服疫苗,保护儿童免受细菌性腹泻的侵染奠定了基础。

K88ac^(+)产肠毒素大肠杆菌eltAB基因缺失对其生物学特性影响的研究

为研究热敏肠毒素(LT)对K88ac+产肠毒素大肠杆菌(K88ac^(+)ETEC)致病能力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了eltAB基因缺失株C83902ΔeltAB,同时将重组质粒pBR322-eltAB电转化至C83902ΔeltAB菌株中获得回补株C83902ΔeltAB/pLT。比较3株菌的生长特性,结果显示相同的条件下,野生株、缺失株和回补株的生长速度无差异;采用ELISA方法检测3株菌感染仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2后细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)浓度,结果显示与缺失株相比,野生株和回补株感染后细胞内的cAMP浓度均极显著上升(P<0.01)。体外对IPECJ2细胞的黏附试验结果显示,缺失株的黏附能力较野生株极显著下降(P<0.01);而回补株的黏附能力得到恢复。采用RT-qPCR检测3种菌株感染IPEC-J2后炎性因子和紧密连接蛋白基因的转录水平,结果显示缺失株感染IPEC-J2细胞后,炎性因子TNF-α和IL-8的mRNA转录水平均极显著下降(P<0.01),而3株菌感染的细胞中紧密连接蛋白编码基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA转录水平均无变化。以上结果表明,LT毒素能够促进K88acETEC菌株对IPEC-J2细胞的黏附和诱导其炎性细胞因子的分泌,但并不能破坏肠道细胞屏障的完整性。本研究为进一步阐明K88acETEC的致病机制提供了重要的参考依据,同时为防治K88acETEC的感染提供了新的策略。

猪源大肠杆菌志贺样毒素2型突变体B亚基与LTB基因的融合与表达

猪水肿病的主要毒力因子是志贺样毒素的2型突变体(Stx2e),毒素的A亚基是有毒的酶活性单位,B亚基无毒,介导毒素与受体的结合。为了增加B亚基的免疫原性,采用重叠PCR将猪源志贺样毒素Ⅱ型突变体B亚单位(Stx2e B)连接至热敏肠毒素的B亚单位(LTB)成熟肽N末端,获得Stx2e B与LTB相连的融合蛋白基因Stx2e B-LTB。融合基因克隆到表达载体pQE30中,在IPTG的诱导下,融合基因在大肠杆菌中获得表达,表达量占细菌总蛋白的8%。融合蛋白的获得为猪水肿病基因工程亚单位疫苗的制备、猪水肿病的预防奠定了基础。

表达LTB乳酸杆菌提高艰难梭菌类毒素疫苗黏膜免疫效应的研究

目的通过构建大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚单位(heat labile enterotoxin B subunit,LTB)乳酸杆菌表达载体,研究其对艰难梭菌类毒素疫苗的黏膜免疫保护效应。方法克隆LTB基因,制备pSIP411-LTB重组质粒,电转化到乳酸杆菌中,制备乳酸杆菌表达LTB载体;通过透析和层析等技术纯化艰难梭菌A毒素和B毒素,经甲醛处理获得的艰难梭菌A毒素和B毒素的类毒素作为疫苗候选抗原;在第0 d、第14 d和第28 d皮下接种小鼠艰难梭菌类毒素和口服乳酸杆菌表达LTB载体;在初次接种后第0 d、10 d、24 d和38 d检测抗A毒素和B毒素的血清IgG和粪便IgA;第34 d,小鼠经口感染艰难梭菌,观察疫苗保护效果。结果成功构建了LTB乳酸杆菌佐剂表达载体和制备了艰难梭菌A毒素和B毒素的内毒素;各疫苗组和疫苗+LTB佐剂组小鼠在感染艰难梭菌后,均无腹泻、体重减轻和死亡现象,而对照组老鼠腹泻发病率为100%,死亡率42.86%,5 d体重下降0.83 g;在初次接种后的10 d、24 d和38 d,与空白组比较,各疫苗组抗A毒素或B毒素的血清IgG及粪便IgA显著升高(F=284.93,1037.05,696.82,74,184.07,166.95,P<0.01);与疫苗组比较,接种疫苗+LTB佐剂组的血清IgG及粪便IgA显著升高(F=21.88,27.22,8.31,56.49,63.76,101.78,P<0.05)。结论艰难梭菌A毒素和B毒素的类毒素作为疫苗的候选抗原对艰难梭菌的感染具有很好的保护效应,LTB乳酸杆菌载体表达佐剂能够提高免疫动物的抗体效价,增强黏膜免疫效应。

中草药抗仔猪大肠杆菌性腹泻作用机理的研究

从中草药对大肠杆菌的体外抑菌活性、对热敏肠毒素LT所致结扎肠袢液体蓄积的拮抗作用、对抗药物性腹泻作用、减少炎性渗出及抑制肠蠕动加快等方面,初步探讨了大青叶、板蓝根、连翘、败酱草4 味中草药及其复方配伍抗仔猪大肠杆菌性腹泻的作用机理。结果表明板蓝根、连翘、败酱草等及其复方制剂对大肠杆菌O149K88均显示出不同程度的体外抗菌活性;将上述中药提取液加入到细菌培养液中与大肠杆菌一起培养,用所得培养物LT进行兔回肠结扎试验,均可显著或极显著地减少培养物上清液所致肠袢液体蓄积量(P<0 05,P<0 01);将败酱草提取液同LT一起注入结扎肠袢,可显著地减少肠袢液体蓄积量(P<0 05);复方组显著或极显著地降低了蓖麻油引起的腹泻发生率和腹泻频率(P<0 05,P<0 01);板蓝根极显著地抑制了小鼠小肠推进率(P<0 01);败酱草、板蓝根和复方组还可显著或极显著地抑制醋酸所致小鼠腹腔染料渗出(P<0 05,P<0 01)。上述试验结果表明:抑制病原菌的繁殖、拮抗热敏肠毒素的致泻作用、对抗药物性腹泻作用、减少炎性渗出及抑制小肠推进运动是治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的重要机理,研究结果为临床应用中草药治疗仔猪大肠杆菌性腹泻提供了重要理论依据。

表达大肠杆菌LT-B/ST融合抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

编码LT-B/ST融合抗原的基因插入pYA248载体中,构建了重组质粒pXZL66。该重组质粒转入无毒鼠伤寒沙门氏菌SR-11,ΔCya,Δcrp,Δasd菌株X4072。此无抗药性的杂合菌株X4072(pXZL66)表达的LT-B/ST融合抗原具有LT和ST抗原性而没有生物毒性,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗候选株。