拟南芥热激因子HSF1的表达与纯化

[目的]表达和纯化拟南芥热激因子HSF1。[方法]以构建的能表达热激因子HSF1的大肠杆菌Escherichia coliM15(pQE32/His6-HSF1,pREP4)为材料,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达HSF1,再通过镍亲和层析纯化表达的HSF1,通过变性的聚丙酰胺(SDS-PAGE)电泳分析表达蛋白和纯化蛋白。[结果]试验获得了表达的HSF1,并且进一步获得了纯化的HSF1。[结论]该研究为探讨拟南芥HSF1在基因组的结合位点提供了试验材料,为全面认识HSF1作用机理和生理功能奠定了基础。

花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。

拟南芥热激因子cDNA的克隆及转化烟草研究

拟南芥热激因子是一重要的耐热基因。从拟南芥幼苗中提取总RNA ,根据报道设计引物 ,利用RT PCR的方法扩增出大约 1.4kb的拟南芥热激因子基因Athsfc。将其克隆入pBluescriptSK载体的XbaI和SacI位点 ,测序结果显示核苷酸序列与国外H櫣ｂｅｌ(1994)报道的Athsf1基因间 99.8%同源 ,只有 3个核苷酸不同。序列分析显示 ,编码相同的氨基酸。将该基因构建入含内含子Km筛选标记的植物双元表达载体pYP12 0 3E中 ,构成了拟南芥热激因子基因 Athsfc植物表达载体pYP12 0 3E(Athsfc)。利用根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)对烟草进行Athsfc基因的转化 ,获得了GUS染色显示阳性的烟草转基因植株 。

热激因子基因AtHSFa1a提高烟草的耐热性研究

克隆了拟南芥热激因子AtHSFa1a,并由热激启动子AtHSP70b控制,构建了双元表达载体pV-70bAtHSFa1a,并经农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株,并检测了其耐热性指标.结果显示:与对照相比,转基因烟草的电导率较低,丙二醛含量增幅较小,SOD酶活性较高,初步表明其对高温具有更高的耐受性.

大鼠热激因子结合蛋白1全长cDNA克隆与分析

热激因子结合蛋白1(heatshockfactorbindingprotein1,HSBP1)是一种新发现的高保守、低分子质量、定位于核中的一种转录因子,它可抑制HSF1的转录域活性,并协同HSP70负调控热激反应。在哺乳动物中仅有人与小鼠的HSBP1cDNA序列被克隆,大鼠中的HSBP1尚未有人报道,我们根据人与小鼠的HSBP1氨基酸的N端和C端保守序列设计了简并引物,采用RT PCR方法从大鼠神经胶质瘤细胞株中克隆大鼠HSBP1的片段,然后采用Southern印迹方法从建立的神经胶质瘤细胞的cDNA文库中调取了它的cDNA全长序列,递交给GenBank,获登陆号为AF522937。并借助于大鼠基因组测序成果,将大鼠HSBP1基因定位于19q12,发现HSBP1基因有3个内含子和4个外显子,其中外显子1和外显子4之间距离5829bp。且对HSBP1的Unigene检索显示HSBP1广泛存在于大鼠各组织、器官中,揭示HSBP1在生理活动中起着非常重要的作用。根据已发表的其他物种的HSBP1的氨基酸序列用DNAman软件做了它的同源关系分析,结果显示进化关系较近的物种中,HSBP1氨基酸序列的相似性与其从形态解剖所得的系统进化关系是一致的。

热激因子研究进展

高温及其他一些化学和生理胁迫能诱导机体产生热激蛋白。真核生物中热激因子调节热激基因的表达。在正常生长条件下 ,热激因子处于钝化的单体状态 ,而当热激时 ,热激因子形成三聚体并与DNA结合 ,同时通过转录激活域的活化而激活热激基因的表达。

谷胱甘肽合成抑制对人热激因子1结合DNA功能的影响

【目的】研究细胞内具抗氧化作用的谷胱甘肽合成受抑制对人热激因子1结合DNA功能的影响。【方法】用谷胱甘肽合成酶抑制剂丁硫堇处理培养中的HeLa细胞,降低细胞内的谷胱甘肽水平,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测细胞谷胱甘肽缺乏时经热激处理后人热激因子1的氧化还原构象改变;通过凝胶电泳迁移率试验检测其与DNA结合的活性变化。【结果】丁硫堇处理后的HeLa细胞,经热激后出现一种在电泳中移动快速、结构致密、分子内二硫键交联的氧化型热激因子1;凝胶电泳迁移率试验结果显示热激因子1与DNA结合活性降低。【结论】谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原状态中起重要作用,谷胱甘肽缺乏导致细胞内氧化型热激因子1蓄积,从而降低热激因子1与DNA结合的功能。

拟南芥热激因子AtHsfA1a在低温胁迫下对细胞程序性死亡中Caspase-3活性的影响

为了研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对低温胁迫下细胞程序性死亡(programmed cell death,简称PCD)中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific protease,简称Caspase)活性的影响,进一步确定拟南芥热激因子AtHsfA1a与低温胁迫中PCD的关系。以热激因子AtHsfA1a不同基因型(野生型、基因沉默型)的拟南芥为材料,首先获得单细胞,于4℃处理1 h后,测定热激因子AtHsfA1a的表达量,发现基因沉默型中AtHsfA1a的表达量低于野生型。接着用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,简称DAPI)进行染色,在荧光显微镜下观察细胞形态,结果表明,低温胁迫后野生型未出现凋亡小体,基因沉默型的细胞出现了细胞凋亡小体。最后根据荧光底物Ac-DEVD-p NA的断裂程度测定Caspase-3活性,结果发现,低温处理后的拟南芥Caspase-3活性明显增强,而AtHsfA1a基因沉默型拟南芥Caspase-3活性比野生型拟南芥的高,说明低温胁迫下拟南芥AtHsfA1a能够抑制Caspase-3蛋白酶的活性。研究结果初步表明,在低温胁迫下拟南芥热激因子AtHsfA1a可以通过抑制Caspase-3蛋白酶的活性而对细胞程序性死亡有一定的抑制作用,这对于揭示植物耐逆境反应机制具有重要意义。

拟南芥热激因子AtHsfA1a对热胁迫中抗坏血酸过氧化物酶的调控（英文）

[目的]为了研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对热胁迫中抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)的调控。[方法]以内源AtHsfA1a基因沉默的转基因拟南芥及野生型植株为材料,热胁迫后,采用分光光度法分析APX酶活性的变化,采用实时荧光定量PCR研究APX基因的表达水平,采用染色质免疫沉淀技术研究AtHsfA1a与APX基因启动子区的体内结合情况。[结果]在热胁迫下内源AtHsfA1a基因沉默植株中的APX的活性和mRNA的表达量均低于野生型,内源AtHsfA1a基因沉默的植株中未筛选出APX基因启动子区片断,而野生型则筛选出APX基因启动子区片断。[结论]AtHsfA1a对APX调控是直接的。该研究为进一步认识AtHsfA1a对植物耐逆境的作用及其应用提供理论依据,对揭示植物耐递境机理有重要意义。

热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响

【目的】探讨热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响。【方法】以T-DNA插入AtHsfA1a基因突变拟南芥及野生型植株为材料,采用分光光度法比较热胁迫下不同基因型植株的抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)活性的变化,RT-PCR法研究AtHsfA1a对APX表达的影响,染色质免疫沉淀技术和凝胶阻滞电泳分析体内外研究AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合情况。【结果】在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中的APX的活性低于野生型,且AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中的APX的mRNA的相对量低于野生型;体内研究发现在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中未筛选出APX基因启动子区片段,而野生型筛选出APX基因启动子区片段,体外研究发现AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合是直接的。【结论】热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥APX的影响是从转录调控水平直接影响APX的表达。

热激因子结合蛋白（HSBP）研究进展

综述了HSF-结合蛋白(HSBP)的结构特点，在热激反应中的作用，以及HSBP对热激转录反应的负调控。

拟南芥热激因子AtHsfA1a对渗透胁迫中Caspase-3酶的调控

以热激因子At Hsf A1a不同基因型(野生型、基因突变型)的拟南芥为材料,PEG处理后采用分光光度法测定Caspase-3酶活性,结果发现渗透胁迫处理后拟南芥Caspase-3酶活性明显增强,而At Hsf A1a基因突变型拟南芥类Caspase-3酶活性比野生型拟南芥的高,说明渗透胁迫下拟南芥At Hsf A1a能够抑制Caspase-3蛋白酶的活性.为了从分子水平进一步鉴定At Hsf A1a与Caspase-3蛋白酶的关系,采用染色质免疫沉淀技术和凝胶阻滞电泳体内外分析At Hsf A1a与Caspase-3酶的关系,结果显示At Hsf A1a在体内外与Caspase-3蛋白酶的启动子片段均有结合.研究结果初步表明,渗透胁迫下拟南芥热激因子At Hsf A1a通过对Caspase-3蛋白酶表达的调控而对细胞程序性死亡有一定的抑制作用,这对揭示植物耐逆境反应机理具有重要意义.

热激因子TaHSF3克隆及其极端温度下表达特点

从地方耐高温品种中克隆出具有完全读码框的热激因子TaHSF3,编码315个氨基酸序列。系统进化树分析表明:TaHSF3属于热激因子(HSF)B2类,与大麦、水稻、玉米和大豆相似性较高;正常生长条件下TaHSF3基因在小麦穗部有高的表达量;在高温和冷冻胁迫处理下TaHSF3能高度表达。TaHSF3基因有利于应对极端温度,可以作为1个候选基因应用在小麦抗性分子育种中,将有可能培育出耐热的小麦新材料。

热激因子对增强植物耐热性的研究进展

热激因子作为生物体在热胁迫和其他胁迫中基因转录激活信号转导通路中的重要成员,能直接启动下游热激蛋白基因的表达,维持细胞内蛋白质的稳态状态。介绍了植物热激因子的种类、结构特点、调控机制及其在不同作物中对高温和其他胁迫下的重要作用。

植物A类热激因子研究进展

热激因子(HSFs)是真核生物中结构和功能上相对保守的一个转录因子家族,多个HSFs家族成员,形成了一个复杂的分子网络,它们能通过诱导多种热激蛋白和抗氧化物酶等效应基因的表达,赋予植物应答热、氧化等逆境胁迫的能力。近年来,植物HSF,特别是A类HSF的研究是一个热点,植物A类HSF已被证明广泛的参与热、氧化等多种胁迫应答,而且还能参与植物发育调节。本文综述了近年来植物A类HSF在研究方法、生理功能和相关调控机制的研究进展,并就其存在的问题和今后可能的研究方向做出展望。

人热激因子-1突变体hHSF190/2在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及其活性研究

目的:在大肠杆菌和毕赤酵母中表达人热激因子(hHSF)-1突变体hHSF190/2,并对其活性进行研究。方法:利用分子克隆技术分别构建了hHSF190/2的原核表达质粒pET45b-hHSF190/2和真核表达质粒pPICZaA-hHSF190/2,分别转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和毕赤酵母GS115进行诱导表达;经纯化除去杂蛋白后,采用蛋白免疫印迹、电泳迁移率变动分析和蛋白转导等方法研究表达产物的功能和活性。结果:hHSF190/2在2个系统中均得到有效表达,都具有与热激元件(HSE)结合的活性,但真核表达产物与HSE的结合能力明显高于原核表达产物;原核及真核系统表达的hHSF190/2都能激发热激蛋白(HSP)70的表达,但真核表达的hHSF190/2活性更高。结论:hHSF190/2有望成为有治疗作用的蛋白药物。

热激对拟南芥热激因子AtHsfA1a表达的影响

为探究热激对拟南芥热激因子AtHsfA1a表达的影响,对过量表达拟南芥热激因子AtHsfA1a的植株进行39℃热激5 min后提取其RNA,应用RT-PCR技术对热激因子AtHsfA1a的RNA进行逆转录和扩增,并对其进行电泳检测.结果表明:过量表达拟南芥热激因子AtHsfA1a的AtHsfA1a在热激和常温下表达量均比野生型高;而且野生型拟南芥和过量表达拟南芥热激因子AtHsfA1a的AtHsfA1a在39℃热激下的表达量比25℃常温下的高,说明AtHsfA1a的表达受热激诱导,结果可为研究拟南芥热激因子AtHsfA1a作用机理提供科学依据.

拟南芥热激因子AtHsfA1a对细胞程序性死亡形态的影响

实验以热激因子At Hsf A1a不同基因型(野生型W和沉默型N)的拟南芥为材料,诱导其形成愈伤组织,将愈伤组织进行悬浮培养至单细胞,热激处理后,经过DAPI染色,在荧光显微镜下观察细胞涂片.结果表明,野生型拟南芥的单细胞均呈大小一致的完整圆形,且染色均匀,为正常的细胞形态.基因沉默型局部发生细胞质的浓缩,出现凋亡小体,说明拟南芥热激因子At Hsf A1a对细胞程序性死亡有一定的抑制作用.

水稻热激转录因子HsfA2b调控非生物胁迫抗性的功能分析

【目的】水稻在生长发育过程中,常会受到各种非生物胁迫而严重影响产量。热激转录因子作为植物抗逆过程中的一个重要元件,通过调控一系列胁迫响应基因的表达以提高植物抗逆性。探究水稻热激转录因子OsHsfA2b调控非生物胁迫的功能与初步机理,为培育水稻抗逆新品种提供了优异基因资源和理论支撑。【方法】通过构建OsHsfA2b过量表达和RNAi的转基因水稻,分别观察水稻幼苗在高温、低温、干旱和高盐处理后的抗逆表型,统计存活率。同时,在逆境胁迫处理后,通过DAB染色检测水稻叶片活性氧(ROS)含量及RT-qPCR检测抗氧化途径相关基因OsSOD和OsCAT的表达量,分析OsHsfA2b对抗氧化途径的调控作用。【结果】在高温、低温、干旱和高盐等非生物胁迫条件下,水稻热激转录因子OsHsfA2b被显著诱导表达。与野生型NPB相比,OsHsfA2b过量表达转基因水稻对非生物胁迫的抗性明显增强,植株损伤程度较轻,存活率提高。相反,OsHsfA2b-RNAi水稻对非生物胁迫更加敏感,植株损伤严重,存活率降低。此外,在非生物胁迫条件下,OsHsfA2b过量表达转基因水稻比NPB和OsHsfA2bRNAi水稻体内活性氧的含量减少,并且OsHsfA2b显著诱导了抗氧化途径相关基因OsSOD和OsCAT的表达,OsHsfA2b参与抑制水稻体内活性氧的积累以降低逆境胁迫诱导的活性氧大量积累对植株的伤害。【结论】非生物胁迫下,水稻热激转录因子OsHsfA2b被显著诱导表达,可通过抗氧化途径正调控水稻对逆境胁迫的抗性。

桃热激转录因子PpHSF18基因的克隆及功能分析

【目的】克隆桃热激转录因子PpHSF18基因,分析其在2种树型桃中的表达,探究其在分枝角度形成中的功能。【方法】测定一年生普通型桃大久保和柱型桃洒红龙柱枝条不同生长时期分枝角度,并分析11个桃PpHSFAs基因在2种树型中的表达;克隆PpHSF18基因,构建PpHSF18基因的过表达载体,并进行拟南芥遗传转化,探究其对拟南芥株型和分枝角度的影响。【结果】柱型桃品种洒红龙柱枝条分枝角度显著小于普通型桃大久保,大久保桃分枝角度随着枝条生长逐渐增大,而洒红龙柱桃分枝角度变化不明显;11个桃A类HSF转录因子家族基因在2种树型桃茎尖中的表达呈3种趋势,其中PpHSF18与PpLAZY1呈相同表达趋势,即在柱型桃中表达量显著高于普通型桃,且与水稻OsHSFA2D同源性最高;PpHSF18三个转基因株系分枝角度均小于野生型拟南芥分枝角度,表明PpHSF18参与植物分枝角度的形成。【结论】过表达PpHSF18导致转基因拟南芥分枝角度变小,为进一步解析PpHSF18在桃分枝角度形成中的作用提供理论依据。