腐烂茎线虫热激蛋白新基因的克隆与序列分析

热激蛋白90基因(heat shock protein 90genes,hsp90s)是与生物发育、生物防御反应以及生物抗环境胁迫等相关的多功能基因。本试验以RT-PCR结合RACE方法从腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个hsp90,命名为Dd-hsp90-1,基因登录号为HQ901595。Dd-hsp90-1cDNA全长序列含有1个2 160bp的开放性阅读框(ORF),编码719个氨基酸残基,其5′末端和3′末端分别含有70bp和117bp的非编码区(UTR)。Dd-hsp90-1内含子外显子结构分析结果表明,其基因组序列包含9个内含子,且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-hsp90-1基因的推定蛋白Dd-HSP90-1分子质量约为82.79ku。该基因为单拷贝基因,并且与其他热激蛋白90基因高度同源。Dd-HSP90-1具有热激蛋白90家族保守的序列和基系。此外,该基因还具有胞质型热激蛋白90的5个特征序列和特异MEEVD基系,这表明Dd-hsp90-1为胞质型热激蛋白90。系统进化分析结果显示,Dd-hsp90-1与松材线虫热激蛋白90基因(GenBank登录号ACY01918)亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达到86.65%。同时,热激蛋白90基因的系统进化分析结果也体现了植物寄生线虫之间的取食行为差异。

拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

【目的】对拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi),为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA,反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用T7RiboMAXTM Express RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),将其配制成120,60,30,15和7.5ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi,共饲喂14d,记录成虫死亡率,确定dsRNA最适质量浓度,并以此剂量对各品级成虫进行干扰,通过荧光实时定量PCR,检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USP mRNA表达的影响。【结果】成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段,其长度523bp,并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现,dsRNA质量浓度越大,拟黑多刺蚁死亡率越高,在dsRNA质量浓度为120ng/μL时,饲喂5d后成虫全部死亡;30ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30ng/μL dsRNA干扰后,荧光实时定量PCR结果表明,拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后,EcR的表达没有显著变化,USP的表达显著降低。【结论】采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达;hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。