利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6

热激蛋白HSP70在肿瘤免疫反应中作用的研究进展

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是细胞受应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白,在进化上高度保守。热激蛋白的功能有很多,充当分子伴侣,参与蛋白质折叠和转运。最近研究表明HSP70还在肿瘤免疫反应过程中起协同作用,充当呈递载体,将抗原肽呈递于APC表面引起CTL毒性杀死感染细胞和肿瘤细胞。在肿瘤的免疫治疗中作为免疫疫苗的载体有很好的前景。

拟南芥热激蛋白HSP70基因片段克隆实验体系的建立

以拟南芥为材料,对热激蛋白HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克隆实验体系.首先提取拟南芥总DNA,接着在热激蛋白HSP70编码区设计引物,扩增出HSP70编码区的片断,再将HSP70编码区的片断加上具有EcoR I酶切位点双链的人工接头,通过EcoR I对其进行酶切.再与经过EcoR I酶切并已经去磷酸化的PUC19载体通过T4连接酶进行连接,然后将连接产物置入到感受态大肠杆菌细胞中(即转化),并让这种细胞在含有Amp+/IPTG/X-Gal的LB培养基上生长.挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒DNA提取,通过酶切质粒DNA,从而初步判断目的片段已被克隆.

黑麦热激蛋白ScHsp90-1基因的克隆及表达分析

本研究从黑麦中克隆了一个热激蛋白Hsp90基因,暂命名为ScHsp90-1,并对其序列进行分析。结果显示,该基因cDNA序列全长2 103 bp,共计编码700个氨基酸,蛋白质分子量约80.47 k D。序列同源性分析表明,ScHsp90-1与小麦、玉米、水稻等物种的热激蛋白同源性较高;进化树分析表明ScHsp90-1与小麦的Ta Hsp90亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术对其表达特性分析表明,ScHsp90-1对高温、低温、高盐、干旱等非生物胁迫均有响应,其可能是黑麦的一个胁迫相关基因。

微囊藻毒素和温度对萼花臂尾轮虫热激蛋白Hsp70水平的影响

微囊藻毒素(MCs)是由有毒蓝藻(尤其是铜绿微囊藻)产生的一类藻毒素,可对水生生物和人类健康造成严重危害,然而目前有关浮游动物对MC-LR胁迫的应激响应研究较为少见.因此,本文探究了微囊藻毒素MC-LR和温度对采自青海西宁的萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)热激蛋白Hsp70水平的影响.结果表明,温度、MC-LR及其交互作用对萼花臂尾轮虫Hsp70含量具有显著影响.在各温度条件下,MC-LR均诱导了轮虫Hsp70水平的上调;虽然Hsp70的表达水平在低剂量MC-LR处理下上调不显著,但在高剂量MC-LR(6 mg·L-1)处理下上调却极为显著;另外,以24℃处理为对照组,在20和28℃温度胁迫下各MC-LR处理组轮虫的Hsp70含量均显著增加,但16℃实验组与24℃对照组间未见显著差异,这可能与诱导轮虫Hsp70表达的环境温度阈值或机体对低温环境的长期适应性进化和调节机制有关.

高温胁迫下B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70表达量的变化

为了探讨热激蛋白在B型烟粉虱Bemisiatabaci B-biotype抵抗高温中的作用,以含有B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70片段的质粒为模板,用TaqMan-MGB探针和特异性引物构建了B型烟粉虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系,并检测了37℃-45℃高温胁迫及气温变化时B型烟粉虱成虫体内hsp70表达的情况。结果表明：缓和的高温对B型烟粉虱成虫hsp70表达具有诱导作用,在37℃-41℃范围内,hsp70的表达量随着温度的升高从8.78×10^5±6.41×10^4拷贝数上升到1.99×10^7±1.45×10^5拷贝数,在41℃时达到最高峰;而当温度升高到43℃和45℃,hsp70表达量迅速降低。B型烟粉虱成虫hsp70的表达与昼夜气温变化有关,当上午气温从34℃上升到41℃时,hsp70的表达量从1.16×10^5±1.48×10^4拷贝数上升到6.29×10^6±1.80×10^5拷贝数;当傍晚气温下降到33℃时,hsp70表达量也下降到2.32×10^5±7.69×10^3拷贝数。因此推测,hsp70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫方面可能具有重要作用。

斑玉蕈热激蛋白基因hsp70在刺芹侧耳中的转化

将斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)热激蛋白基因hsp70通过农杆菌介导的方法对刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)进行遗传转化,PCR验证得到刺芹侧耳抗性转化子。试验表明:潮霉素浓度为70μg/mL,乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,侵染时间为90 min,共培养时间为2 d时转化率最高。

Bright Yellow 2烤烟热激蛋白90生物信息学分析

【目的】分析Bright Yellow 2烤烟热激蛋白90(HSP90)的生物学信息,为揭示烘烤过程中烟叶的烘烤特性提供理论依据。【方法】从NCBI中获取Bright Yellow 2烤烟HSP90蛋白序列Nt HSP-1、Nt HSP-2和Nt HSP-3(Gen Bank登录号分别为BAL42333、BAL42332和BAM24708),利用生物信息学软件对各序列进行理化特性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级结构和三级结构预测分析。【结果】Bright Yellow 2烤烟Nt HSP-1、Nt HSP-2和Nt HSP-3的氨基酸数量分别为812、811和699个,均以酸性氨基酸含量较多,其中谷氨酸(Glu)含量最高,理论等电点均小于5.00,二级结构均以α-螺旋(H)和无规则卷曲(C)为主。Nt HSP-1和Nt HSP-2的亲水性较高,具有较高的稳定性,属于分泌蛋白,具有锚定结构,定位于内质网,其三级结构呈现"r"形,N端内部具有Mg2+结合位点、HATPase_c(ATP酶)和top6b(DNA拓扑异构酶VI)功能域;Nt HSP-3为非分泌型蛋白,定位于叶绿体,三级结构呈现"i"形,N端含有Mg2+结合位点和HATPase_c功能域。【结论】Nt HSP-1和Nt HSP-2可能与烟叶耐烤性有关,而Nt HSP-3可能与烟叶易烤性有关。

热激处理诱导柰李热激蛋白的研究

植物组织受到高温胁迫时诱导产生的热激蛋白(HSPs)能提高植物的抗冷性。对不同温度与时间组合(36℃,4h或8h;40℃,4h或8h;44℃,0.5h或1h)的热激处理诱导柰李产生热激蛋白,提高柰李抗冷性的效果进行了研究,结果表明:热激温度以36℃～40℃,热激时间以4h效果较好。

作物热激蛋白研究进展及应用

热激蛋白(Heat Shock Protein,HSP)是生物体在多种刺激下产生的一种蛋白质。主要阐述了HSP的发现和研究概况,综述了HSP的种类及定位,HSP与植物的耐热性、抗冷性、作物品质以及与种子发育的关系;介绍了HSP在作物育种、生长发育及凋亡中的作用。

热休克及菌胁迫对厚壳贻贝HSP70基因表达的影响

70 ku的热激蛋白(HSP70)具有细胞内分子伴侣和细胞外免疫调节功能,是受到热激、重金属、干旱、疾病、寄生虫感染等条件胁迫后产生的诱导蛋白。本实验利用同源克隆法,获得厚壳贻贝HSP70基因1 700 bp的核心序列,BLAST比对和系统进化分析显示,该序列与已知的双壳贝类相应分子高度同源,其中与紫贻贝HSP70基因相似性高达96%,在进化树中两者位于同一分支。37℃热激后,厚壳贻贝肝胰腺和鳃中HSP70基因的表达快速上调,2 h即达到对照组30倍,随后持续上升,肝胰腺中最高表达量达到对照组100倍,说明厚壳贻贝HSP70分子为典型的热诱导蛋白。鉴于大肠杆菌及枯草芽孢杆菌是水体中常见微生物,进一步利用实时荧光定量PCR技术检测上述两种细菌感染后,HSP70基因在厚壳贻贝鳃和肝胰腺中的表达水平,结果显示,两种细菌均可引起厚壳贻贝鳃和肝胰腺的HSP70基因表达上升,但大肠杆菌诱导效应显著,8 h时表达量达到最高,鳃为对照组的4倍,肝胰腺为4.5倍,随后逐渐下降,到48 h已恢复到原始水平;枯草芽孢杆菌刺激后,肝胰腺组织中最高表达量在刺激后6 h约为对照组2.5倍,与注射PBS的效果相差不大,鳃组织的响应较肝胰腺组织明显,表达量缓慢升高,8 h达到最高,为对照组4倍,随后迅速下降,直至生理水平。研究表明,厚壳贻贝HSP70分子在调节环境胁迫及宿主免疫防御中具有重要功能。

大豆蚜Aghsp75基因对吡虫啉及温度胁迫的应激表达

热激蛋白在昆虫抵御温度胁迫和药剂胁迫反应中具有重要作用。本试验通过高通量测序获得一条大豆蚜热激蛋白基因的cDNA序列,该序列全长2982 bp,含1个长度为2052 bp的开放阅读框,编码683个氨基酸组成的多肽,多肽等电点约为6.30,分子质量约为77.8 kDa;推导的氨基酸序列与棉蚜Aphis gossypii HSP75同源性高达99.12%,属于hsp 75家族。我们把该基因定名为Aghsp75,已提交至GenBank(登录号为MN068810)。Aghsp75通过不同浓度吡虫啉药剂和不同温度胁迫成蚜后发现,经LC50吡虫啉浓度胁迫3、6和24 h时以及在LC30浓度吡虫啉胁迫12 h时该基因表达量显著升高;经6℃处理6 h时以及36℃处理3 h和6 h时该基因表达量显著升高。本研究表明该基因可能参与大豆蚜的抗逆过程,为利用分子生物技术手段防治大豆蚜提供理论保障。

植物热激转录因子在非生物逆境中的作用

非生物逆境通常导致生物体内蛋白变性。热激蛋白(Hsp)作为分子伴侣协助蛋白的重新折叠、稳定、胞内运输和降解,以阻止受损蛋白的累积,维护细胞内环境的稳定。而热激蛋白的表达是通过热激转录因子(Hsfs)结合于热激蛋白基因的启动子的热激元件上(heatshockelement,HSE),以募集其它转录因子而形成转录复合体,促进热激蛋白基因的表达。植物热激转录因子比动物系统更为多样性。根据其基本的结构域,植物热激转录因子可分为三类:HsfA、HsfB、HsfC。A类Hsfs已有大量深入的研究和报道,特别是在番茄方面。HsfB和HsfC的作用尚不清楚。在其复杂的网络中,每一热激转录因子均有其独特的作用,取决于其表达模式、亚细胞定位、聚合化、活性及与其他蛋白的相互作用。在非生物逆境,尤其是热激逆境下,A类热激转录因子在调节热激蛋白的表达起着重要作用。番茄的HsfA1起着主导作用,其缺失无法被其他相近的Hsfs所取代,但在持续热逆境下,在HsfA1的配合下,HsfA2可成为主要调节因子。B类热激转录因子可作为A类Hsfs的阻抑蛋白。然而,基于对不同的单个突变体的研究,以及对酵母Hsf1致死突变体的拯救恢复,一些热激转录因子的作用又是丰余的。此外,热激蛋白也对热激转录因子起负反馈调节作用。

大豆Hsp20基因家族生物信息学分析及高温高湿胁迫响应的分析

热激蛋白(Hsps)家族中的小热激蛋白(Hsp20)在保护植物免受非生物胁迫方面发挥至关重要的作用,为探究大豆Hsp20家族基因的特性及其对高温高湿胁迫的响应,对大豆进行了全基因组分析,本研究采用生物信息学方法对进化关系、保守结构域、染色体位置、启动子顺式调控元件和组织特异性表达情况进行预测分析,并采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对湘豆3号和宁镇1号两个大豆品种在高温高湿胁迫下不同时间的蛋白表达量进行了分析。结果表明:在大豆基因组中共查找出33个GmHsp20基因,不均匀分布在16条染色体上并根据系统发育分析和亚细胞定位结果分为11个亚族。序列分析表明GmHsp20蛋白表现出较高的结构保守性,含有典型的ACD结构域,32个GmHsp20基因(96.96%)没有内含子,或只有1个内含子。启动子分析表明,GmHsp20基因含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,其中MYB数目最多(110)个。基因组织特异性表达预测分析结果显示,除GmHSP22.6外,其余基因在各种组织和器官中均有表达。其中GmHSP18.5、GmHSP23.7、GmHSP15.2基因在所有组织中均高度表达。蛋白定量分析结果表明,与对照相比,宁镇1号和湘豆3号两个品种中,经高温高湿胁迫处理后,GmHSP18.5、GmHSP23.7、GmHSP26.0B、GmHSP17.8、GmHSP25.95个蛋白均上调表达,并且在两个品种间表达趋势基本一致,表明这些小热激蛋白家族成员可能参与了大豆对高温高湿胁迫的应答反应过程。本研究结果为进一步研究大豆小热激蛋白GmHsp20家族成员的功能提供有价值的信息。

拟南芥Hsp20基因家族的特征及其在干旱和盐胁迫下的表达分析

热激蛋白20(heat shock protein 20,Hsp20)是植物响应非生物胁迫时广泛合成的一类功能蛋白质,参与植物的抗逆过程。借助拟南芥基因组数据库,利用生物信息学方法分析Hsp20基因家族。HMMER搜索和蛋白质的理化性质分析表明,拟南芥至少含有30个Hsp20基因,其编码蛋白的分子质量为14.6~41.4 kD,且均含有α-晶状体蛋白结构域。系统发育分析表明,在30个拟南芥Hsp20成员中,22个归属于12个不同的亚家族,其余8个归于未知分类,可能为Hsp20类蛋白质(Hsp20-like)。共线性分析表明,片段复制与串联复制是Hsp20成员的主要扩增事件,大部分Hsp20不含或只含1个内含子。MEME分析结果表明,基序1、2、9是Hsp20共有的保守基序。转录组分析提示,15个Hsp20的表达水平在干旱和(或)盐胁迫后出现了上调,该结果得到了qRT-PCR实验的验证。以上结果为人们进一步探究Hsp20基因的生物学功能提供了理论依据。

不结球白菜幼苗耐热性机制初步研究

以不结球白菜品种苏州青(耐热)和矮脚黄(不耐热)幼苗为材料进行热激处理(40℃,0、6、12、24、48、72和96 h),测定了热激处理对不结球白菜叶片中保护酶活性、丙二醛(MDA)含量以及膜透性的影响,同时利用实时定量PCR(qPCR)技术检测叶片中BcHsp1和BcHsp2耐热基因的表达变化。结果表明:热激处理后,耐热品种叶片中SOD、POD和CAT活性的增幅大于不耐热品种;不耐热品种叶片中丙二醛含量和电解质渗透率的增幅大于耐热品种;相对于不耐热品种,耐热品种热激蛋白基因具有明显稳定的热激诱导表达特性。

高温下3种壳色虾夷扇贝存活率、代谢率、免疫酶活力及HSP70表达的比较研究

以3种壳色虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)(枫叶贝、红贝、白贝)为实验材料,将在15℃暂养的3种壳色虾夷扇贝分别驯化至20,22,24和26℃4个温度梯度(升温幅度为1℃/d),待各处理组达到对应温度梯度后暂养7 d,测定比较3种壳色虾夷扇贝的存活率、耗氧率和排氨率、抗氧化酶活力和热激蛋白HSP70表达等指标。结果表明:随着温度的升高,3种壳色的虾夷扇贝的存活率呈先上升后下降趋势,其中,白壳色虾夷扇贝的存活率在同一处理组中最高;3种壳色的虾夷扇贝耗氧和排氨率均随温度升高呈现先升高后降低的趋势,同一温度处理组下白壳色虾夷扇贝的代谢率始终高于红贝和枫叶贝;另外,总抗氧化能力(total-antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧酶(activity of superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)4种免疫酶的活性随温度升高也呈现先升高后降低的趋势,且同一温度处理组下白壳色虾夷扇贝的免疫酶活力始终高于红贝和枫叶贝;3种壳色虾夷扇贝鳃HSP70的表达模式基本相同,随着温度的逐渐升高,HSP70持续表达,到26℃时表达量最高,且白壳色扇贝HSP70的相对表达量最高为5.07。综上,白壳色虾夷扇贝在高温应激下表现出较强的抵抗和耐受能力,因此,可将其作为后期耐高温型虾夷扇贝新品系的重要培育材料。

短时高温胁迫对褐飞虱存活及其热激蛋白基因hsp70表达的影响

为探讨短时高温胁迫对褐飞虱成虫存活的影响及热激蛋白基因hsp70在此过程中的作用,通过室内试验观察羽化24 h内的褐飞虱成虫经过不同高温（31~40℃）暴露和不同恢复时间（1~72 h）后的存活及其体内hsp70表达情况,并构建了褐飞虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系。结果表明,褐飞虱在31~39℃下暴露2 h对其成虫存活无显著影响,39.5℃下其存活率显著降低,为44.4%,40℃下无成虫存活;在37℃下暴露2 h后,在12 h的恢复时间内褐飞虱的存活率与对照组无显著差异,但随着恢复时间延长存活率迅速下降。缓和高温（31℃和33℃）对褐飞虱成虫hsp70表达具有诱导作用,其表达量分别为对照组的3.8和6.7倍;在35℃和37℃时达到最高峰,为对照组的291.2和232.5倍;当温度达到39℃和39.5℃时hsp70表达量呈下降趋势,但仍为对照组的46.7和26.2倍。褐飞虱37℃处理2 h后,随着恢复时间的延长,hsp70基因表达水平迅速下降,恢复48、72 h时,仅为对照组的0.4和0.7倍。推测该基因的表达在褐飞虱抵抗短时高温胁迫过程中具有重要作用。

沙葱萤叶甲热激蛋白基因GdHsp10a的克隆、分子特征与表达分析

为明确热激蛋白HSP10在沙葱萤叶甲Galeruca daurica生长发育过程中的作用,采用RTPCR及RACE技术克隆沙葱萤叶甲Hsp10基因cDNA的全长序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,并利用qPCR技术对该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段、成虫羽化后不同时期以及不同温度下的表达谱进行分析。结果表明,克隆获得1条新的沙葱萤叶甲Hsp10基因,命名为GdHsp10a,GenBank登录号为MG460308,cDNA序列全长为526 bp,开放阅读框为333 bp,编码蛋白含110个氨基酸,预测分子量为11.97 kD,等电点为9.74;无信号肽及跨膜结构。同源比对及系统进化分析表明,GdHSP10a与光肩星天牛Anoplophora glabripennis HSP10亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为53.15%。qPCR结果表明,GdHsp10a在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫期的表达量显著高于幼虫期、预蛹期及蛹期;成虫羽化后不同时期表达量差异显著,25 d时表达量最高,其次为100、10和7 d时的表达量;温度对GdHsp10a表达量有显著影响,30℃下表达量最高,35℃下表达量次之,15、20、25及40℃下表达量最低且无显著差异。表明GdHsp10a可能在沙葱萤叶甲生长发育及成虫越夏中起着多重作用。

JNK介导的细胞凋亡

JNK介导细胞凋亡的作用与多种疾病的发生有关,因此有关JNK促细胞凋亡分子机制的研究不断深入。本文综述了与JNK介导细胞凋亡相关的多种疾病并概括了JNK促细胞凋亡的主要的上游激活物和下游分子信号途径,同时根据近年来研究热点,强调了Hsp72作为JNK天然抑制剂对于抑制JNK信号通路激活的重要性。JNK又称为应激活化蛋白激酶,在应激条件下JNK激活,进而引发细胞凋亡等生理变化,从而对机体产生不利影响。而在畜牧养殖生产中,环境等的应激因素往往是不可避免的,因而减少应激以及应激时细胞内JNK的激活将有利于经济动物的健康生长,明确JNK的促凋亡机制并寻求且充分利用其有效的天然抑制剂对于疾病治疗以及畜牧经济发展具有重要意义。