水稻热激转录因子HsfA2b调控非生物胁迫抗性的功能分析

【目的】水稻在生长发育过程中,常会受到各种非生物胁迫而严重影响产量。热激转录因子作为植物抗逆过程中的一个重要元件,通过调控一系列胁迫响应基因的表达以提高植物抗逆性。探究水稻热激转录因子OsHsfA2b调控非生物胁迫的功能与初步机理,为培育水稻抗逆新品种提供了优异基因资源和理论支撑。【方法】通过构建OsHsfA2b过量表达和RNAi的转基因水稻,分别观察水稻幼苗在高温、低温、干旱和高盐处理后的抗逆表型,统计存活率。同时,在逆境胁迫处理后,通过DAB染色检测水稻叶片活性氧(ROS)含量及RT-qPCR检测抗氧化途径相关基因OsSOD和OsCAT的表达量,分析OsHsfA2b对抗氧化途径的调控作用。【结果】在高温、低温、干旱和高盐等非生物胁迫条件下,水稻热激转录因子OsHsfA2b被显著诱导表达。与野生型NPB相比,OsHsfA2b过量表达转基因水稻对非生物胁迫的抗性明显增强,植株损伤程度较轻,存活率提高。相反,OsHsfA2b-RNAi水稻对非生物胁迫更加敏感,植株损伤严重,存活率降低。此外,在非生物胁迫条件下,OsHsfA2b过量表达转基因水稻比NPB和OsHsfA2bRNAi水稻体内活性氧的含量减少,并且OsHsfA2b显著诱导了抗氧化途径相关基因OsSOD和OsCAT的表达,OsHsfA2b参与抑制水稻体内活性氧的积累以降低逆境胁迫诱导的活性氧大量积累对植株的伤害。【结论】非生物胁迫下,水稻热激转录因子OsHsfA2b被显著诱导表达,可通过抗氧化途径正调控水稻对逆境胁迫的抗性。

茭白热激转录因子基因的鉴定与分析

为探究热激转录因子(heat shock transcription factor,HSF)基因家族在茭白耐热性中的功能及潜在应用,本试验以‘龙茭2号’为材料,利用生物信息学手段,鉴定出28个茭白HSF蛋白并对其进行分析。理化性质分析表明,茭白HSF家族蛋白的理论等电点为4.77~11.63,分子量为16.77~101.29 kDa,氨基酸长度为239~661个氨基酸,不稳定系数均大于40。多序列比对发现其DNA结合域具有高度保守性,长约为100个氨基酸。通过MEGA 7.0软件构建茭白、拟南芥、毛竹和水稻的HSF蛋白系统发育树,发现HSF蛋白可以分为A、B、C 3个分支,茭白HSF家族中含有17个A类成员、7个B类成员、4个C类成员。进一步通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析高温胁迫下茭白HSF基因家族的表达模式和热胁迫生理指标,结果表明,有14个HSF基因在高温胁迫(42℃,12 h)后处于高表达水平(表达量提高10倍以上),其中Zl HSF-04、ZlHSF-12、ZlHSF-27表达量上调最明显,与常温对照组(CK)相比分别上调37倍、36倍、44倍;同时,高温胁迫下茭白幼苗叶片出现大面积失水失绿的现象,叶片干枯卷曲,且光系统Ⅱ最大光化学效率较CK降低了49.9%,而相对电导率,丙二醛、脯氨酸、过氧化氢含量与CK相比分别增加了409%、97%、396%和99%。本结果为进一步研究HSF基因家族在茭白热激响应中的功能提供了理论依据。

拟南芥热激转录因子HSFA2基因克隆与原核表达

为了进一步阐明HSFA2功能,现采用Trizol法分离拟南芥叶片总RNA,用RT-PCR方法得到拟南芥HSFA2基因,经过连接、转化和蛋白诱导对其进行了原核表达研究。结果表明:从拟南芥叶片中分离到了高质量的总RNA,进而扩增到了目的基因,将其连入表达载体PGEX-KG,且转入大肠杆菌BL21中。不同温度条件下的诱导结果表明,16℃下蛋白诱导效果较好。采用这套系统,可以使AtHSFA2得以较好的表达。

大白菜热激转录因子基因家族鉴定及表达分析

本文以大白菜基因组数据为基础，利用生物信息学方法对大白菜热激转录因子（heatshocktranscriptionfactors，HSFs）进行了序列特征分析。结果表明，大白菜至少含有30个HSF基因成员，蛋白质序列长度在239～487氨基酸之间；序列多重比对发现，大白菜HSF基因具有高度保守的DBD结构域和广泛的保守基序；染色体定位揭示了除2个基因分布在Scaffold上，其余28个基因在大白菜的10条染色体上呈不均匀分布，Chr03上分布最多；此外，大白菜和拟南芥HSF基因的系统发育关系比较分析表明，这些HSF基因家族成员可以分为A、B、C三类，A类和B类可进一步分为8个和4个亚组，并且存在8对直系同源基因和4对旁系同源基因，表明HSF基因家族存在于芸薹属和拟南芥属分化之前。RT—qPCR分析表明，高温胁迫显著了诱导了大部分大白菜HSF转录因子基因的表达，表明这些基因广泛地参与了大白菜苗期叶片对高温热激反应。

农杆菌介导法将热激转录因子8基因转入大豆

植物转化是开展基因工程育种和鉴定基因功能的重要途径。本研究的目的在于向大豆受体导入热激转录因子8(heatshockfactor8,hsf8)基因,以加强目的基因hsp70的表达和增加转基因大豆的抗逆性,同时探索提高大豆转化率的途径。本文以大豆子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将hsf8基因转入栽培大豆品种科新3号中,获得了13株抗卡那霉素的转化植株。PCR检测表明,其中的9株呈阳性反应,证明hsf8基因已整合到大豆基因组中。本实验获得的实际转化率为2.39%。文中讨论了选择适宜的种子灭菌方法和大豆受体品种对提高转化率的有效作用。

农杆菌介导热激转录因子8基因转化大豆

环境胁迫严重影响作物的生长和发育,热激转录因子(heat shock factor 8,HSF)是一类在热应激反应中起重要作用的蛋白质,主要功能是在热休克基因的表达过程中与相应热激元件结合,启动基因的转录过程,最终促进热休克蛋白(HSP)基因的表达。本文将热激转录因子8(hsf8)基因构建在植物表达载体pCAMBIA3300中,以大豆子叶节作为受体,通过农杆菌介导法将hsf8基因导入品质性状优良的两个高产大豆新品系哈交5337和哈交5489中,最后获得转基因植株。在开展大豆遗传转化过程中,探讨了农杆菌介导大豆子叶节转化体系的影响因素,优化了转化条件。在共培养后,采用延迟筛选的方法来提高选择效率。并确定草胺磷筛选浓度为3.5mg/L。获得转化质粒pCAMBIA3300-HSF8的转基因植株,其中T1代PCR阳性植株17株。采用Real-timePCR的方法对T1代抗性植株进行hsf8基因的转录水平的相对定量分析,确定9株较非转基因植株哈交5337表达量明显提高。有1株明显低于哈交5489的hsf8基因表达量。

大豆热激转录因子GmHsFA1对高温和干旱信号的表达反应

本研究将热激转录因子GmHsFA1基因构建在植物表达载体pCAMBIA3300中,以大豆子叶节作为受体,通过农杆菌介导法将热激转录因子GmHsFA1基因导入到高产品种黑农53中,获得一批转基因株系。采用Real-time PCR的方法对各代株系GmHsFA1基因的转录水平进行相对定量分析,确定转基因大豆中热激转录因子GmHsFA1的表达量明显提高。利用转热激转录因子GmHsFA1大豆研究了高温和干旱胁迫下,大豆热激转录因子GmHsFA1应对高温和干旱信号的基因表达,生理生化特性,光合特性及产量性状的变化反应,采用胁迫系数与灰色关联分析相结合方法,对转GmHsFA1基因大豆的耐热性和抗旱性进行综合鉴定和评价。结果表明:转热激转录因子GmHsFA1大豆品系在高温和干旱诱导条件下,大豆叶片中GmHsFA1、GmHSP70、GmHSP22和GmHSP17.9基因的表达量明显高于非转基因受体黑农53,叶肉细胞中的脯氨酸含量和可溶性糖含量明显高于受体,丙二醛含量增幅较小,叶片的光合特性受胁迫变化较小,光合特性能力和产量性状表现高于受体,表明过量表达的热激转录因子GmHsFA1大豆植株的耐热能力和抗干旱能力得到明显的提高。

玉米热激转录因子基因ZmHsf25的克隆、特性与耐热性功能分析

植物热激转录因子(heat shock transcription factor,Hsf)对下游热激蛋白基因及耐热性相关基因的表达起关键调控作用。玉米中至少有30个Hsf家族成员,其中B族有7个。在前期对玉米A1亚族热激转录因子基因ZmHsf06克隆及特性、抗旱耐热性功能分析的基础上,从玉米幼叶中克隆到B族热激转录因子基因ZmHsf25的完整编码序列,序列全长957 bp,编码318个氨基酸残基。蛋白质序列含有DNA结合结构域、核定位信号序列和核输出信号序列,同源分析结果显示,ZmHsf25与高粱Sb06g025710的相似性最高,达92%。荧光定量分析表明,正常生长条件下,ZmHsf25在玉米多个组织器官中表达,幼嫩花粉中高表达,幼嫩根系和雌穗中表达量较低。42℃热胁迫能显著上调根系和叶片ZmHsf25的表达,叶片中上升幅度高于根系,处理50 min达到峰值;正常条件下,水杨酸和H2O2处理均使根系和叶片ZmHsf25表达下调,而热激条件下却表现为显著上调。通过在洋葱表皮细胞中瞬时表达并观察GFP荧光,确定ZmHsf25定位在细胞核。通过转化酵母并进行热胁迫处理发现,热胁迫同时降低正常和转ZmHsf25酵母的耐热性,但与转空载体对照相比,转基因酵母的耐热性更强。推测ZmHsf25参与玉米热胁迫响应和花粉的发育过程,可能是水杨酸热激信号转导途径的下游组分。研究结果为进一步探明玉米热激转录因子家族成员的特性与功能提供了依据。

百合热激转录因子基因LlHsfC1的鉴定、表达与亚细胞定位

为了深入研究百合热激反应的分子机制,以麝香百合杂种系品种‘白天堂’为试验材料,鉴定了百合C类Hsf基因LlHsfC1,其开放阅读框为780 bp,编码259个氨基酸,推定蛋白质分子质量为30.1 ku,理论等电点为9.61.LlHsfC1蛋白含有热激转录因子的特征结构域,但与百合A类Hsf相比,LlHsfC1缺少转录激活模序和核输出信号.亚细胞定位分析表明LlHsfC1在细胞核中表达.37℃胁迫处理显著促进了LlHsfC1的表达;LlHsfC1的表达受热胁迫与Ca^(2+)处理协同诱导.此外,构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-LlHsfC1,为进一步研究LlHsfC1基因的功能提供了基础.

白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析

白颖苔草(Carex rigescens(Franch.)V.Krecz.)的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多重比对设计简并引物,扩增出白颖苔草的热击转录因子基因cDNA的中间片断,并在此基础上利用RACE技术得到3′端cDNA片段和5′端cDNA片段。结果表明:通过序列拼接获得该基因的全长cDNA(1226bp),命名为CrHSF。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框(103～1023bp),编码蛋白质含有306个氨基酸,分子量为38.75kDa,等电点为5.85。CrHSF的氨基酸序列与OsHSF的同源性为59%,与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在CrHSF的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域,但是具有多种翻译后修饰的加工位点。

玉米热激转录因子基因ZmHsf06表达提高拟南芥耐盐性

在对从玉米幼叶中获得热激转录因子基因ZmHsf06生物学特性及转基因拟南芥植株耐热性和抗旱性评价的基础上,从表型和生理水平对转ZmHsf06基因植株的耐盐性进行了鉴定。表型观察结果显示,盐胁迫下转ZmHsf06拟南芥植株根系和地上部长势明显强于野生型;生理指标分析发现,盐胁迫下转基因植株能保持相对较高的叶片SOD、POD、CAT活性和叶绿素含量,以及相对较低的相对电导率、丙二醛含量,且叶片渗透势升高明显。结果表明,ZmHsf06不仅能提高植株耐热性和抗旱性,在一定程度上对提高植株的耐盐性也发挥重要作用,是玉米热激转录因子家族主要成员之一。

棉花热激转录因子基因的克隆及其序列分析

利用RACE技术克隆出的棉花热激转录因子基因片段的3′端序列为探针,对棉花EST数据库进行BLAST搜索,筛选与探针高度同源的EST序列,再利用DNAMAN软件进行拼接,获得了棉花Hsf基因(GhHsf)。生物信息学分析表明,GhHsf基因的开放阅读框为1 515bp,编码504个氨基酸,分子量为55 513.7Da,理论等电点为5.45。具有热激转录因子家族固有的氨基酸保守结构域,并且与主要的高等植物Hsf具有较高的同源性。棉花热激转录因子的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域。

铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及生物信息学分析

【目的】鉴定铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并进行生物信息学分析,为深入研究该家族在铁皮石斛热应激响应中的调控机制提供理论参考。【方法】以拟南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列为参考序列,在铁皮石斛蛋白数据中搜索其同源蛋白序列,利用SMART和Pfam数据库鉴定出其Hsf基因家族成员。利用生物信息学方法对铁皮石斛Hsf基因家族组成、基因结构、启动子区顺式作用元件及其编码蛋白结构域和进化关系等进行分析。【结果】共鉴定获得23个铁皮石斛Hsf基因家族成员,编码氨基酸数量为132～514个,平均343个,多数属于酸性蛋白和亲水性蛋白,可分为HsfA、HsfB和HsfC组,其中HsfA组成员13个、HsfB组成员9个、HsfC组成员1个。除DoHsfA3仅包含motif 1和motif 2外,其他HsfA组蛋白均含有motif 1～motif 5,HsfB和HsfC组蛋白均缺少motif 5。铁皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亚类成员,与同属于单子叶兰科植物的小兰屿蝴蝶兰Hsf蛋白亲缘关系最近。HsfA组成员包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋(CC)功能域,HsfB和HsfC组成员缺少或含不完整的CC功能域。DoHsfA1A蛋白具有保守的丝氨酸—苯丙氨酸—缬氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列。铁皮石斛Hsf基因启动子区含有大量激素响应、胁迫响应和生长相关元件。【结论】铁皮石斛Hsf基因家族成员进化较保守,其生物学功能存在明显物种特异性,进化关系较复杂,推测其在不同的非生物胁迫和植物激素信号途径中发挥潜在"节点"作用。

普通烟草热激转录因子家族的全基因组鉴定与分析

热激转录因子(heat shock transcription factor, Hsf)家族成员广泛参与植物生长发育和非生物胁迫的调控。本研究应用生物信息学和比较基因组学方法从普通烟草中鉴定了49个Hsf家族成员,发现这些Hsf家族成员均具有较为保守的寡聚化结构域。通过系统进化分析可将烟草和拟南芥的Hsf家族成员划分成3个分支与14个亚家族。共线性分析显示烟草Hsf基因与双子叶植物(拟南芥,番茄和葡萄)Hsf基因组成共线基因对的数量要大于与单子叶植物(水稻和玉米)Hsf基因组成共线基因对的数量。全基因组复制预测共有12个NtHsf基因可组成7条复制基因对。启动子分析发现NtHsf基因启动子区域存在着多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件。表达模式分析证实NtHsf家族成员在不同组织的表达具有差异,并且大多数NtHsf家族成员可响应热和干旱胁迫。研究结果可为烟草Hsf转录因子家族成员的功能研究奠定生物信息学基础。

玉米热激转录因子基因ZmHSF05的克隆与功能分析

该研究通过RT-PCR扩增和测序从玉米幼苗中克隆到一个高温胁迫诱导的热激转录因子(heat shock transcription factors,HSFs)基因,命名为ZmHSF05,其开放阅读框(ORF)长度为1080 bp,编码359个氨基酸。序列分析发现,ZmHSF05具有热激转录因子蛋白的典型结构特征,含有一个DNA结合域(BD)和一个AHA激活功能结构域(AD/AHA),并且具有核定位信号(NLS)。亚细胞定位分析发现,pEGAD-ZmHSF05融合蛋白仅分布在细胞核中,表明ZmHSF05基因定位于细胞核。对ZmHSF05基因起始密码子ATG上游2102 bp序列进行顺式作用元件分析发现,该启动子区域包含多个激素和逆境胁迫响应元件。定量RT-PCR结果表明,ZmHSF05基因在根中表达水平较高,并且受高温、干旱和盐胁迫上调表达。转基因功能分析发现,ZmHSF05基因的拟南芥超表达株系耐热性显著提高,说明ZmHSF05对植物的耐热性具有正向调控作用,该研究为深入理解植物耐热性分子机制提供了新依据。

二倍体棉花热激转录因子HSFs家族全基因组生物信息学分析

热激因子(heat shock factors,HSFs)是生物体内调节热激应答的一类转录因子,在热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要的作用。从已释放的二倍体亚洲棉和雷蒙德氏棉全基因组测序结果中分别鉴定到42个和40个HSFs蛋白家族成员,运用生物信息学分析其序列特征、亚细胞定位、聚类分析和保守基序等。结果表明,亚洲棉HSFs蛋白长度116~526个氨基酸,分子量13 748.4~60 028.2 u,等电点4.40~8.75;雷蒙德氏棉HSFs蛋白长度为190~528个氨基酸,分子量21 993.0~60 413.6 u,等电点4.36~9.50。染色体定位显示二倍体棉花中的HSFs基因不均匀分布在13条染色体上;聚类分析表明,HSFs蛋白序列分为A、B、C 3类,每一亚类中二倍体棉花与拟南芥的蛋白具有较高的同源性,趋向于聚集在一起,且每个亚组具有相同或相似的保守基序类型及排列顺序。

小麦热激蛋白转录因子C家族基因的结构及其在干旱胁迫中的表达

小麦热激蛋白转录因子在热胁迫和耐热性产生的过程中发挥重要作用。为进一步了解小麦热激蛋白转录因子C亚家族,本研究采用全基因组信息保守结构域比对和进化聚类分析,共鉴定了24个小麦TaHsfC基因,并对TaHsfC亚家族成员染色体定位、基因结构、亚细胞定位、对应蛋白质的氨基酸特点、基因表达进行了分析。结果表明,24个TaHsfCs主要分布在5条染色体上,其中A基因组中有7个,B基因组中9个,D基因组中有6个,另外两个所在染色体位置不清楚。TaHsfCs含有0~2个内含子,其中TaHsfC1亚族基因含有1~2个内含子,TaHsfC2亚族基因则含有0~1个内含子。聚类分析表明,小麦TaHsfC成员共分为TaHsfC1和TaHsfC2两个亚族。24个TaHsfCs成员全部定位于细胞核。在15%PEG模拟干旱条件下,干旱敏感品种矮抗58和耐旱品种晋麦47中有10个TaHsfC基因显著上调表达,其中TaHsfC2亚族基因的表达量上调倍数均高于TaHsfC1亚族基因(其中TaHsfC2j和TaHsfC2k未在晋麦47中检测到表达量)。本研究可为探索小麦热激蛋白转录因子C家族基因在小麦抗旱中的分子机制提供一定的理论支撑。

小叶杨热激转录因子基因的克隆及单核苷酸多态性分析

热激转录因子(heat shock transcription factor,HSF)在调节植物对逆境胁迫(特别是热胁迫)应答和相关基因表达方面起重要作用。笔者采用RT-PCR方法,首次从小叶杨基因组DNA中分离出热激转录因子基因,并进行测序和序列分析。结果表明:小叶杨HSF基因总长度为2884bp,基因内部含有完整的编码阅读框架,即编码区为1398bp,可编码466个氨基酸残基,所推导的蛋白质序列与拟南芥和葡萄HSF蛋白的同源性分别为63%和78%。组合利用MEGA3.1和DNASP4.0软件对小叶杨16株基因型个体的HSF序列进行比对和分析,共检测到107个SNP位点,多态性频率为1/27bp,其中常见SNP为42个,罕见SNP为65个。在PsHSFB基因内部发生的单核苷酸变异中,71个属于转换,36个属于颠换。在外显子区域,共检测到52个SNP位点,其中15个为同义突变,37个为错义突变。本研究为小叶杨热激转录因子基因的连锁不平衡作图及其基因辅助小叶杨抗逆性状的分子育种提供重要的理论依据。

番茄热激转录因子HSF家族的系统进化分析

热激转录因子(heat Shock factors)普遍存在于整个生物界中,在调控植物生长发育以及对环境的响应中起重要作用。目前,已经对多个物种的HSF基因进行生物信息学分析,但未见对番茄中HSF基因家族的分析报道。通过番茄基因组数据库,鉴定和分析番茄HSF转录因子家族,获得24个HSF基因家族成员。多重序列比对发现番茄HSF基因具有保守的DBD结构域和广泛的保守基序。根据与拟南芥基因系统进化分析将这些基因分类,分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ支,又将Ⅰ支分成A、B、C 3个亚支,并且存在5对旁系同源蛋白和10对直系同源蛋白。染色体分布和遗传分析结果表明,番茄HSF基因存在于10条染色体上,呈不均匀分布。

水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究

为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。