经密码子优化的耐热纤维素酶在大肠杆菌中的表达

为了提高质粒pHsh-celD在大肠杆菌中的表达量,运用mRNA二级结构预测软件对pHsh-celD翻译起始区的二级结构进行优化,得到了具有最佳mRNA二级结构及自由能的质粒pHsh-celD I。为了进一步提高纤维素酶的表达量,在不改变目的基因翻译的氨基酸序列的前提下,celD的N-端氨基酸尽可能地使用大肠杆菌同义密码子,定点突变后得到质粒pHsh-celD II。优化后质粒pHsh-celD II表达的纤维素酶活[(6.4±0.4)U/ml]是未优化[(4.1±0.3)U/ml]的1.6倍。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为66 000,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性好,这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

海栖热袍菌极耐热纤维二糖磷酸化酶在大肠杆菌中的克隆和表达

将来源于极端嗜热菌属海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的编码纤维二糖磷酸化酶的结构基因cepA与新型热激质粒pHsh连接,得到重组质粒pHsh-cepA。将重组质粒pHsh-cepA转入大肠杆菌JM109进行表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为90kD,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好。这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

耐热纤维素酶在大肠杆菌中的高效表达及酶学特性分析

将来源于热纤梭菌（Clostridium thermocellum ATCC 27405）的编码内切β-1,4-葡聚糖酶的结构基因（celD）分别插入到pHsh和pET两个表达系统,分别得到质粒pHsh-celD和pET-20b-celD。将重组质粒转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中表达,在pET系统表达时形成包涵体,采用热激表达系统pHsh在大肠杆菌表达时实现了纤维素酶的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子质量为66kD,与理论值相符。纯化的纤维素酶的最适反应pH为5.4,在特性不同的pH条件下60℃保温30 min,重组纤维素酶在5.4-7.8的pH范围内比较稳定,在75℃下酶的半衰期约为1 h,Ca^2＋可以增强酶活,而EDTA则会抑制酶的活性。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好,这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

基于温控载体表达胆固醇氧化酶

胆固醇氧化酶在医药检测、食品加工、农业生产等方面都有重要的应用价值。以来源于Rhodococcus sp.的胆固醇氧化酶基因为研究对象,构建于温控表达载体p Hsh上,免去了诱导剂的使用,采用温度调控使胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中成功表达。在摇瓶水平对酶的表达量进行优化,最终的酶量为855 U/L。使用镍柱将酶纯化,得到单一条带,相对分子质量约为55 k Da。分析其酶学性质,最适p H 7.0,在p H 5.0～7.0稳定;最适反应温度40℃,在50℃保温,其半衰期为6.9 min。以胆固醇为底物,在p H 7.5、37℃条件下测酶活,计算得动力学参数K_m为3.38 mmol/L,k_（cat）/K_m为6.09 s-1·（mmol/L）。

多功能半纤维素酶的构建及其酶解应用分析

以前期构建的来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)和来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus DSM 5826)木聚糖酶A(XynA)融合酶为基础,在融合酶的两个催化结构域间插入多肽Linker,并通过优化Linker组成和长度避免催化结构域互相之间的干扰,以增强融合酶的催化效率。通过酶解燕麦木聚糖和麦麸试验发现,带有多肽Linker的融合酶催化效率得到了提高。

Prokaryotic Expression and Purification of Heat Shock Factor HSF1 in Arabidopsis thaliana

[ Objective ] This study was to express and purify Arabidopsis thaliana heat shock factor HSF1. [ Method ] Using Escherichia coli M15 harboring HSF1 （pQE32/His6-HSF1, pREP4） as experimental materials, HSF1 was induced to express with isopropyl-β-D-galactoside （IPTG） ; then the expression product was purified using Ni-NTA-agarose affinity chromatography and analyzed by SDS-PAGE. [Result] HSF1 of Arabidopsis thaliana was successfully expressed and purified. [ Conclusion] This study provides materials for understanding the blinding site of HSF1 on Arabidopsis thaliana chromosome, further laying a good foundation for revealing the regulatory mechanism and physiological function of HSF1.

海栖热袍杆菌来源的极耐热碱性果胶裂解酶的表达、纯化及定性

将来源于极端嗜热菌属海栖热袍杆菌Thermotoga maritima MSB8的编码碱性果胶裂解酶的结构基因pelA与新型热激质粒pHsh连接,得到重组质粒pHsh-pelA,运用mRNA二级结构预测软件对pHsh-pelA的翻译起始区的二级结构进行优化,得到了具有最佳mRNA二级结构及自由能的质粒pHsh-pelC。将重组质粒pHsh-pelC转入大肠杆菌JM109（DE3）进行表达,得到了一种极耐热性碱性果胶裂解酶（PelC）。对重组酶的酶学性质研究发现,该酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为8.5,在pH 8.2-9.8之间酶活力稳定,95℃酶活半衰期为2 h,并且该酶依赖Ca^2＋作为活性离子。在工业生产常用温度60℃下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。以多聚半乳糖醛酸（PGA）为底物时,其动力学参数Km值为0.11 mmol/L,Vmax值为327 U/mg。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子量为43 kD,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好,这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质

从海栖热袍菌扩增出编码乳酸脱氢酶的基因并将其插入热激载体pHsh构建表达质粒,在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达产生极耐热性乳酸脱氢酶Tm-LDH。基因表达产物通过热处理,可以一步获得接近电泳纯的重组酶。酶学性质研究表明,Tm-LDH的最适反应温度为95℃,最适pH 7.0;纯酶在90℃的半衰期为2 h,在pH 5.5–8.0之间最稳定;SDS-PAGE结果显示分子量为33 kDa,与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时,相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L,Vmax为3.8×104 U/mg;相对于NADH的Km值7.2 mmol/L,Vmax值为1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达,但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达,表达水平达到340 mg/L。该酶在65℃反应条件下,活性达到最高活性的50%,并能保持活性不变,这使该酶能够与常温酶匹配,在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。