利用CRISPR/Cas9技术构建CTCF蛋白降解细胞系

CTCF是脊椎动物关键的绝缘子蛋白,在细胞生命过程中发挥重要作用,敲除CTCF基因会导致小鼠胚胎死亡。为进一步探讨CTCF的功能,本文利用CRISPR/Cas9介导的同源重组,在内源性CTCF表达框上游敲入一个有丝分裂期降解结构域(Mitosis-special degradation domain,MD),该结构域可以带动CTCF融合蛋白在M期降解。作为对照,将MD结构域的第42位的精氨酸突变为丙氨酸,形成无降解活性的MD*,可使MD*-CTCF融合蛋白始终稳定存在。将嘌呤霉素与融合蛋白同时表达,即可利用抗生素筛选,高效地筛选到纯合克隆。利用蛋白印迹技术和免疫荧光检测3种细胞在不同细胞周期的CTCF蛋白变化情况,发现MD-CTCF细胞系CTCF蛋白含量约为野生型细胞的10%,MD*-CTCF细胞系的CTCF含量与野生型没有显著差别;通过流式细胞术观测降解CTCF对细胞的影响,发现MD-CTCF细胞系G1期明显延长。总之,利用CRISPR/Cas9技术在CTCF表达框上游高效地插入MD,首个CTCF特异性降解的人类细胞系获得成功构建。

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。

嗜热厌氧杆菌热稳定CRISPR/Cas9基因组编辑技术及在细胞工厂构建中的应用研究进展

嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)来源的菌株作为一个高温发酵的细胞工厂,具有生产生物燃料和化学品的潜力,已引起了研究者的广泛兴趣。随着嗜热厌氧杆菌属来源的多个菌株全基因组测序的完成以及相关的生理生化实验的开展,建立一个简便、快捷的基因操作技术将有助于进一步深入理解和认识嗜热厌氧杆菌有关的代谢途径。最近,成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas)的基因编辑技术在嗜热菌中被开发应用。文中综述了嗜热厌氧杆菌的研究进展和热稳定性CRISPR/Cas9基因组编辑技术在嗜热厌氧杆菌的发展和建立,并对该编辑技术在其他嗜热菌未来发展的趋势提出参考意见。嗜热菌热稳定性的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立和完善不仅可以促进嗜热菌遗传改造技术的发展,而且有助于提高嗜热菌遗传育种和代谢工程改造的效率。

热休克蛋白HSP90B1影响牛病毒性腹泻病毒复制的研究

旨在探究热休克蛋白90β家族成员1(heat shock protein 90 beta family member 1,HSP90B1)对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的影响。本研究通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测BVDV感染MDBK细胞后HSP90B1 mRNA和蛋白的表达情况,利用CRISPR/Cas9技术构建HSP90B1 KO细胞,计数检测敲除HSP90B1对细胞生长的影响,BVDV TC株感染HSP90B1 KO和对照组Scramble细胞后,使用qRT-PCR、免疫荧光、病毒滴度以及细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)检测BVDV的复制情况。结果表明,qRT-PCR检测显示BVDV感染24 h时与空白组相比HSP90B1 mRNA转录水平显著升高(P<0.05),36 h后极显著升高(P<0.01),同时Western blot显示BVDV感染组HSP90B1蛋白的表达水平较未感染组明显增加;Western blot检测显示,与MDBK细胞相比HSP90B1 KO细胞中的HSP90B1蛋白表达量明显降低;细胞计数显示,相同生长时间的Scramble、HSP90B1 KO细胞与MDBK细胞的数量未见差异;qRT-PCR结果显示,与对照组相比,HSP90B1 KO细胞中BVDV 5′UTR RNA水平在BVDV感染12 h后显著降低(P<0.05),36 h后极显著降低(P<0.01);免疫荧光检测结果显示,与对照组相比,HSP90B1 KO细胞中的绿色荧光明显减少;BVDV感染后病毒滴度与对照组相比,12 h后HSP90B1 KO的病毒滴度显著降低(P<0.05),36 h后极显著降低(P<0.01),CPE显示,在感染12 h后对照组细胞出现明显CPE,而HSP90B1 KO细胞仅显示出少量CPE,感染36 h后HSP90B1 KO细胞出现明显CPE,此时对照组细胞出现大量CPE并有细胞脱落。以上结果表明BVDV诱导MDBK细胞中HSP90B1的表达;利用CRISPR/Cas9技术成功敲除MDBK细胞的HSP90B1基因,构建HSP90B1 KO细胞,试验表明敲除HSP90B1能够抑制BVDV的复制。

Crispr/Cas9技术在CHO细胞中进行基因定点敲入的应用

工业生产中,哺乳动物细胞是重组蛋白类药物最常用的表达系统之一,但重组细胞株经常在表达量及产品质量方面不尽理想。在基因组中定点整合外源基因则可以极大地改善细胞株的生产能力及产品质量。Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编辑技术,在动植物细胞中得到了广泛应用。基于已有文献和本实验室经验,本文主要介绍了Crispr/Cas9技术在工业生产常用细胞系中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行基因定点整合的方法,并介绍了应用Crispr/Cas9技术进行基因定点敲入的案例。