大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位CTB和大肠杆菌热稳定肠毒素ST的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二者的不同是,前者为单拷贝ST,后者为双拷贝ST。在大肠杆菌DH5α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。

大肠杆菌热稳定肠毒素表位与霍乱毒素B亚单位的重组与表达

霍乱毒素B亚单位(CTB)是半抗原的良好载体,选择CTB基因的翻译调控元件,实现了串联重复的突变型大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)表位与CTB的重组,在大肠杆菌中高效分泌表达,经过亲和层析获得了高纯度的重组蛋白,ELISA表明重组蛋白仍保留与神经节苷脂GM1的结合能力和CTB的免疫原性。

肠聚集性大肠杆菌热稳定肠毒素1(EAST1)的研究进展

肠聚集性大肠杆菌热稳定肠毒素1(enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1,EAST1)是一种新型致病性肠毒素,对人类和动物肠道健康具有潜在威胁,由astA基因编码。EAST1最早在肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)中被发现,然后在肠道病原性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)中被检测到,只含有EAST1唯一毒素的大肠杆菌定义为肠聚集性大肠杆菌热稳定性肠毒素1大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 Escherichia coli,EAST1EC)。astA基因存在多种基因型,不同astA基因型表达的EAST1毒性不同。EAST1的致病机理与Ⅰ型热稳定肠毒素(heat-stable enterotoxinⅠ,STa)具有相似性。笔者对EAST1的流行情况、不同astA基因型及EAST1的致病机理进行综述,目的是为astA基因的分型和EAST1的致病能力研究提供理论依据。

热不稳定大肠杆菌肠毒素B亚单位免疫调节功能的实验研究

目的 :探讨大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LTB)的免疫调节功能及其可能的机制。方法 :用SephacrylS 10 0凝胶柱层析纯化LTB蛋白。选用BALB/c小鼠 ,以鸡溶菌酶 (HEL)为抗原 ,经鼻黏膜单独免疫 ,或以不同剂量的LTB为佐剂与HEL共免疫。用ELISA法检测血清和肠分泌液中HEL特异性抗体的水平。用3 H TdR掺入法 ,体外测定LTB蛋白对刀豆蛋白A(ConA)及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应的影响。结果 :HEL单独免疫组血清中仅有弱的抗HELIgG ,未检测到抗HELIgA ,且其肠分泌液中亦未见HEL特异性IgA抗体。但加用LTB佐剂的 3个组 ,其血清中抗HELIgG、IgA的水平及肠分泌液中抗HELIgA的水平均显著高于HEL单独免疫组 (P <0 .0 0 1)。体外实验显示 ,LTB可明显抑制ConA及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应。结论 :我们制备的LTB蛋白对免疫系统具有双向的调节功能 ,既可作为有效的黏膜佐剂 ,辅佐外来抗原刺激机体产生黏膜免疫应答 ,又具免疫抑制效应 ,有效地抑制淋巴细胞活化。LTB免疫调节功能的发挥 。

一种粘膜免疫佐剂——大肠杆菌热不稳定肠毒素研究现况

大肠杆菌热不稳定肠毒素是霍乱毒素的同源家族 ,具有良好的免疫原性和强效佐剂效应 ,作为粘膜抗原的载体分子广泛用于粘膜免疫。本文就该毒素及其亚单位在佐剂应用、免疫类型及免疫途径等方面的研究作了综述。

大肠杆菌热不稳定肠毒素无毒突变体LTR72基因重组质粒的构建

用PCR方法扩增大肠杆菌LT基因 ,将LT基因重组入pET32a质粒载体 ,对构建的重组质粒pET LT进行酶切、核苷酸序列分析 ,结果表明 ,插入片段LT的核苷酸序列与预期一致 ,且阅读框正确。并在影响LT毒性的关键氨基酸位点 ,用PCR方法引入点突变 (丙氨酸→精氨酸 ) ,成功构建了含有LTR72突变体基因的重组质粒pET LTR72。

贵州羔羊致病性大肠杆菌血清型和热稳定性肠毒素的研究

从腹泻羔羊中分离到大肠杆菌80株,对80株菌株做血清型鉴定,55株为埃希氏大肠杆菌。分属为O119、O34、O8、O78O101、O96种血清型,其中O119、O24为主要“O”类型。每个血清型筛选出的CH9612、SC9938、CH986、CH9817、LL9934、GL988株菌6株。用乳鼠胃内投服试验,测定出6株菌具有产生热稳定性肠毒素的特性(ST)。

生化方法检测毒力因子以诊断热不稳定肠毒素大肠杆菌导致的腹泻

目的:探讨PCR及生物化学方法对确定ETEC的分子特性和毒力谱的重要意义,并通过检测毒力基因eltA的存在诊断热不稳定(LT)肠毒素产生的ETEC导致的腹泻。方法:采用RT-PCR方法,确认两株大肠杆菌为热不稳定的ETEC。被动胶乳凝集实验将被用来测试样品中LT毒素的存在。结果:在这项研究中,样本1和样本3均表达eltA基因,乳胶凝集显示样本3的呈阳性。结论:染色结果提示此腹泻儿童极有可能感染了热不稳定的ETEC。

嗜水气单胞菌分离株的鉴定与菌株肠毒素及致病性研究

目的对嗜水气单胞菌进行鉴定并进行肠毒素检测与致病性分析。方法采用常规法分离培养,电子显微镜观察形态,用法国梅里埃VITEK32全自动微生物鉴定仪进行系统鉴定。乳鼠灌胃法测定热稳定性肠毒素(ST),小白鼠腹腔注射法测定其毒力。结果检出的嗜水气单胞菌均产热稳定性肠毒素(ST),具备较强的致病性。结论分离的嗜水气单胞菌具有较强毒力,与致病性密切相关。

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。

大肠杆菌毒素stx2eB-LTB-ST融合基因的构建与表达

利用PCR技术,从病原性大肠杆菌中扩增Stx2e及LT毒素B亚基的基因并扩增ST基因,用复式PCR技术获得了这三段基因的两种融合结构,一种是三段基因直接相连,另一种是在这三段基因之间加入适当的Linker序列。在这两种融合基因两端加入适当的酶切位点并分别与pMD18-T载体相连,酶切后以正确的阅读框插入pET28a载体的多克隆位点中,转入受体菌BL21(DE3)进行表达,得到两种约28 Ku的蛋白,表达的融合蛋白均以包涵体的方式存在,约占全菌蛋白表达量的30%,将包涵体初步提纯,为下游工作奠定了基础。

大肠杆菌表达的融合蛋白VP4-STⅠ的免疫效果研究

研究表明，肠毒素是ETEC致幼畜腹泻的根本原因，由ETEC产生的肠毒素包括热敏感肠毒素（LT）和热稳定肠毒素（ST），其中ST又包括STⅠ和STⅡ。调查表明，几乎所有的腹泻幼畜只要分离到ETEC．大部分都产生STⅠ。但是，由于STⅠ的分子质量太小，几乎没有免疫原性，因此，通过基因融合的方式借助大分子物质提高STⅠ的免疫原性是当前国内外学者致力于ETEC疫苗开发的重点。轮状病毒系呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）的成员，是致幼畜病毒性腹泻最主要的病原体，其中外膜蛋白VP4不仅是轮状病毒血清学分型的依据，而且是主要的保护性抗原。

鸟苷素研究进展

鸟苷素为最近发现的含有１５个氨基酸的肽类，是强大的内源性大肠杆菌热稳定肠毒素（ＳＴａ）受体激活物。它可激活鸟苷酸环化酶，刺激小肠细胞中Ｃｌ－分泌。蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）可能是这种反应的主要介导物，胆囊纤维化跨膜调节物（ＣＦＴＲ）是信号通路的最后共同的效应器。

LT-B转基因烟草植株的建立

目的 构建大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LT B)基因的植物表达载体 ,并建立LT B转基因烟草植株。方法 用PCR从pMMB6 8扩增LT B编码基因 ,将其克隆于 pUCmT和 pBI12 1载体 ,进而构建植物表达双元载体pBI LTB ,LT B基因由CaMV 35S启动子控制表达 ;将pBI LTB用电穿孔法导入根瘤农杆菌LBA4 4 0 4 ;采用叶盘共培育法经根瘤农杆菌介导转化烟草 ,获得转基因烟草植株 ;用PCR、Southern、Westernblot和ELISA检测转基因植株。结果 经PCR及Southern杂交分析 ,共发现 12株烟草的基因组中有LT B基因整合 ;Westernblot和ELISA分析表明有 9株转基因烟草能有效表达LT B蛋白 ,其表达量为烟草叶片总可溶蛋白的 3.36～ 10 .5 6 μg·g-1TSP。结论 建立的LT B转基因烟草植株可成功表达LT B ,并具有五聚体结构 ,为进一步生产预防婴幼儿大肠杆菌腹泻可食用疫苗及黏膜免疫佐剂奠定了基础。

产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性

目的观察产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性。方法将含ETEC抗原成分热不稳定肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB)的双歧杆菌疫苗给SD大鼠灌胃4次,同时设对照组,以PBS平行灌胃。采用ELISA法检测大鼠粪便上清液IgA及血清IgG抗体水平;免疫组化法检测大鼠空肠中sIgA抗体的表达;肠绊试验检测肠毒素的活性。结果免疫疫苗的SD大鼠粪便上清液中产生了IgA抗体,血清中产生了特异性的IgG抗体,肠道内产生了特异性分泌型sIgA抗体;免疫组化结果显示,随着免疫次数的增加,抗体分泌量明显增加;双歧杆菌疫苗免疫的大鼠能够抵抗LT抗原的侵袭,而对照组大鼠则出现明显的肠道积液现象。结论构建的双歧杆菌疫苗具有良好的免疫效果,可保护SD大鼠免受ETEC的感染。

LTB-MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白。方法应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性。结果重组工程菌可以表达相对分子质量约为54000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性。结论已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达。

引起羊腹泻的传染病的诊断

1大肠杆菌病 大肠杆菌可引起羔羊病和败血症两种类型。羔羊病多在出生后48小时即可出现兽医临床症状,大多因母羊乳房被污染,羔羊饮奶被感染的结果。肠杆菌能分泌热稳定肠毒素和K99吸着因子,肠上皮细胞在外毒素作用下迅速被破坏,细菌大量繁殖,可引起羔羊迅速死亡,或短期内表现腹痛,疲乏无力。