甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因BnECR的克隆及功能分析

反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase,ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。根据已报道拟南芥ECR基因设计引物,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR的全长cDNA序列和对应的基因组序列,命名为BnECR(GenBank登录号分别为FJ899705和FJ899706)。序列分析结果显示,BnECR的全长cDNA序列为1328bp,对应的基因组序列为2093bp,由4个外显子组成,在ORF的上、下游分别有一个163bp的5′UTR和一个232bp的3′UTR。根据编码区预测BnECR前体蛋白为一个310个氨基酸残基的多肽链,包含ECR蛋白的重要功能位点K144、R145及一个NAD(P)H结合基序G225SGGYQIPR/HG234。NCBIBlastn、氨基酸序列多重比对及保守域分析表明,该基因与拟南芥AtECR基因的同源性最高,是对应拟南芥AtECR的垂直同源基因。RT-PCR分析表明,BnECR基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花及角果中均有表达,其中在茎中的表达量最高。BnECR在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子,表明BnECR可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。将BnECR克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中,分别转化野生型酵母By4743和突变体菌株YDL015c,添加半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明,BnECR在酿酒酵母中有效表达,转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的1.34%,比对照增加52%;对突变体的转化结果表明芥酸含量恢复到野生型水平。

野油菜黄单胞菌中烯脂酰ACP还原酶的功能鉴定

烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一.本研究通过生物信息学分析发现,野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris(Xcc)8004基因组中XC_0119(Xccfab V)注释为反-2-烯脂酰Co A还原酶基因.但其编码产物与铜绿假单胞菌的烯脂酰ACP还原酶Fab V具有较高的同源性,并含有相同的催化活性中心Tyr-(Xaa)8-Lys序列.用携带Xccfab V的质粒载体互补大肠杆菌fab I温度敏感突变株JP1111,转化子能在42℃生长,表明Xccfab V能遗传互补大肠杆菌fab I突变.体外重建脂肪酸合成反应表明,Xcc Fab V能催化不同链长的烯脂酰ACP还原为脂酰ACP,且催化活性不受三氯森抑制.遗传学研究表明,Xccfab V是必需基因,不能获得Xccfab V基因敲除突变株.将携带大肠杆菌fab I的外源质粒导入野生菌后,可敲除染色体上的fab V基因,获得的替换突变株生长特性和脂肪酸组成未发生显著变化,但替换突变株对三氯森敏感.上述结果证实,野油菜黄单胞菌fab V是必需基因,编码烯脂酰ACP还原酶,参与脂肪酸从头合成反应,且Fab V是Xcc对三氯森耐受的根本原因.

油桐烯脂酰CoA还原酶的克隆与表达模式分析

以葡萄桐近成熟种子为材料,根据油桐转录组数据库中已知部分烯脂酰CoA还原酶(enoyl-CoA reductase,ECR)序列,利用RACE克隆技术,克隆得油桐烯脂酰CoA还原酶的全长c DNA序列,命名为VfECR,并对该基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列的理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构域、蛋白质的二、三级结构、亲缘关系进行分析。结果表明:该基因全长1 154 bp,含有一个933 bp的开放阅读框,编码310个氨基酸,属于不稳定的亲水性蛋白,含有6个明显的跨膜结构域,且与陆地棉ECR蛋白的同源性最高,亲缘关系最为接近。同时利用RT-qPCR对VfECR基因的组织特异性和种子发育过程中的表达模式进行了分析,发现油桐Vf ECR基因主要在种仁中表达,在根、茎、叶等组织中表达量较少;在种子发育过程中,近成熟(8月、9月)到成熟种子(10月)中的表达量要明显高于未成熟种子(6月、7月)。

分子动力学模拟三氯生对烯脂酰-ACP还原酶作用机制研究

本文利用分子动力学模拟分别研究了蛋白sa Fab I体系、sa Fab I-NADP+体系和sa Fab I-NADP+-TCL体系的稳定性、各氨基酸残基随模拟时间的波动情况以及活性位点处关键氨基酸残基构象的变化规律.研究表明,辅酶NADP+及抑制剂三氯生均可在不同程度上促使蛋白构象稳定.辅酶NADP+可以促使活性位点Loop区残基Y147-Y157残基构象变为规则的卷曲构象;抑制剂三氯生可以促使蛋白与底物结合位点Loop I区残基I94-E108和Loop II区残基R194-F204及活性位点Loop区残基Y147-Y157残基构象变为规则的卷曲构象,构象趋于稳定.上述研究发现对认识三氯生作为抗菌药物机制及相关药物设计具有重要指导意义.

流产布氏杆菌烯脂酰ACP还原酶的鉴定

烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一.流产布氏杆菌基因组有2个注释为烯脂酰ACP还原酶基因fabI的同源基因:fabI1和fabI2.由这2个fabI同源基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌FabI有50%和51%的同源性,且都拥有与大肠杆菌FabI一样的催化中心Tyr-(Xaa)6-Lys序列.分别用携带这2个同源基因的质粒载体转化大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株JP1111.转化子能在42℃生长,表明这2个基因均能遗传互补大肠杆菌fabI突变,并使此菌株恢复脂肪酸的合成.另外,体外酶学分析显示,由这2个同源基因编码的蛋白质都拥有烯脂酰ACP还原酶活性,均能参与细菌脂肪酸合成.上述结果证实,流产布氏杆菌同时拥有2个同种类型的烯脂酰ACP还原酶,是一种新的烯脂酰ACP多样性的表现.

苜蓿中华根瘤菌烯脂酰ACP还原酶基因fabI1的功能研究

我们先前的工作表明,苜蓿中华根瘤菌的烯脂酰ACP还原酶基因fabI1在nifA突变根瘤中表达水平降低.本研究构建了fabI1的定点插入突变体.与野生型相比,突变菌株的生长速度变慢,在高浓度NaCl培养基上的生长能力降低.在半固体培养基上,该突变体的涌动能力完全丧失.在共生过程中,突变菌株在宿主植物上延迟结瘤,形成根瘤的能力下降.虽然苜蓿中华根瘤菌中的烯脂酰ACP还原酶基因fabI2的序列与fabI1有66%的一致性,但fabI2不能恢复fabI1突变体的表型,揭示了这两个基因在功能上的差异.

3-S-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1,2,4-三唑的合成及抗菌活性

以自制的5-取代芳基-4-氨基-3-巯基-1,2,4三唑为底物,经糖基修饰后,在甲醇钠/甲醇/二氯甲烷体系中经水解脱除糖环上的乙酰基,得到9个新化合物5-取代苯基-4-氨基-3-S-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1,2,4-三唑(6a^6i),其结构经核磁共振波谱(1H NMR,13C NMR),红外光谱(IR)和高分辨质谱(HRMS)确认.生物活性测试结果表明,目标化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均显示出良好的抑菌活性.化合物6g对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度分别达到2,8,32和8μg/m L,抑菌效果接近或优于对照药物三氯生和氟康唑.利用Autodock程序研究了目标化合物(6a^6i)与大肠杆菌烯脂酰还原酶(FabⅠ)受体蛋白分子的相互作用和结合自由能变化规律.

基于反义RNA技术的FabI抑制剂筛选模型的构建

目的基于反义RNA沉默技术构建针对细菌FabI的超敏全细胞筛选模型，用于筛选FabI抑制剂。方法以Escherichia coli基因组DNA为模板，PCR扩增屈6，基因的-74～86bp核苷酸序列，反向插入携带pairedtermini结构的反义质粒pHN678中，得到重组质粒pHNF，再转化至E-coli中，得到反义工程菌E．coli／pHNF；通过平板表型观察对反义工程菌进行筛选；考察了IPTG浓度对筛选模型的影响，确定96孔板抗菌筛选模型的条件，并用三氯生作为阳性对照、氨苄西林和浅蓝菌素作为阴性对照对该模型进行评价。结果获得了针对廊6，的反义工程菌，确定了最适IPTG浓度为40μmol／L，成功构建了FabI特异性酶抑制剂的超敏全细胞筛选模型，并验证了其可行性。应用该筛选模型对5847个内生真菌次级代谢产物进行活性筛选，初筛阳性率约为9．7％，经复筛后获得8份阳性样品。结论成功建立了基于反义RNA沉默技术的FabI超敏全细胞筛选模型，并利用该模型筛选到8份阳性样品。