亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的表达亚洲带绦虫(Taenia asiatica,Ta)成虫烯醇化酶(enolase,ENO)基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。方法通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a(+),在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。结果PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a(+)-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量(Mr)为47000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。结论纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。

扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因的原核表达及抗原性鉴定

为表达扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)的烯醇化酶(Enolase),本研究采用RT-PCR方法以M.expansa组织总RNA为模板扩增enolase基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a中,并转化BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示表达的重组Enolase约为47 ku。Western blot分析表明,天然蛋白能够被重组表达产物免疫小鼠的血清识别,出现两条免疫印记条带,即天然蛋白以两种形式(约47 ku和40 ku)存在,并具有抗原性,为该蛋白功能研究奠定了基础。

地黄烯醇化酶基因(RgENO)的生物信息学与表达分析

【目的】研究地黄烯醇化酶基因(RgENO)的生物信息学功能及其表达情况。【方法】利用高通量测序对混合地黄发育块根进行转录组测序,通过基因注释得到地黄烯醇化酶基因(RgENO)序列,RgENO为780 bp,编码260个氨基酸的蛋白质。利用生物信息分析软件对RgENO进行同源性比对、结构、跨膜结构区和信号肽分析;用RT-qPCR检测其空间表达。【结果】RgENO蛋白质相对分子量为27.7 Kda,理论等电点pI为7.69,具有烯醇化酶典型的C端与N端双结构域,属于TIM磷酸结合超家族,不具有跨膜结构和信号肽,与芝麻的烯醇化酶相似度约为98%;RgENO在地黄的根、茎和叶中均有表达,但差异不明显。【结论】RgENO的编码蛋白质与芝麻的烯醇化酶相似度最高,约为98%;其在地黄根、茎和叶中均有表达。

滑液支原体烯醇化酶基因的克隆表达及其表达产物活性的测定

参照GenBank中滑液支原体P53株序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得滑液支原体WVU1853菌株烯醇化酶基因并将其克隆至pGEM-T Easy,测序并完成点突变后构建重组表达质粒pET-28a-eno,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后纯化表达产物并测定其酶促活性。结果显示,表达产物具有水解酶活性,最适pH为7.5,最适温度为50℃,Mg2+可作为酶活性辅因子,相同浓度的Zn2+可提高酶活性,而Mn3+、Al 2+、Ni 2+、Ba2+和Li+对酶活性均有不同程度的抑制作用;其米氏常数(km)和最大反应速率(Vmax)分别为1.1×10-3 mol/L和0.739μmol/(L.min)。

扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因的克隆及其组织表达差异分析

为了探索烯醇化酶基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用,通过基因质粒文库克隆分析了扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因mRNA的全长序列,同时应用SYBRGreenreal-timeRT-PCR方法检测了该基因在虫体4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节的组织表达差异。序列分析结果表明,该基因全长1691bp,编码445个氨基酸,蛋白的理论分子质量为48.94ku,等电点为5.56,是含有螺旋和不规则卷曲较多的疏水性蛋白。相似性分析结果显示,其基因表达产物与肝片吸虫氨基酸的相似性达74.8%,属于磷酸丙糖异构酶磷酸盐结合蛋白家族。Real-timeRT-PCR结果表明烯醇化酶基因在虫体各发育阶段的表达丰度差异显著,其从高到低依次为成节、幼节、孕节和头节。据此推测该烯醇化酶基因在虫体寄生过程中对细胞内物质的代谢与能量的产生起关键作用。

猪带绦虫烯醇化酶基因的原核表达及鉴定

为了探索猪带绦虫烯醇化酶基因的生物学功能,以猪带绦虫幼虫cDNA为模板,PCR扩增获得烯醇化酶基因的ORF,并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒。经IPTG诱导表达后,纯化表达产物,采用免疫印迹法分析表达产物的免疫反应性,并测定它与纤溶酶原的结合特性及酶活力。结果显示,该基因的ORF大小为1 302bp,表达大小约为53ku的重组蛋白;表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清识别;该重组蛋白具有纤溶酶原结合特性及酶活力。据此推测,猪带绦虫烯醇化酶可能在寄生虫入侵宿主过程中发挥作用,有作为药物靶标或疫苗候选分子的潜力。

水稻OsENO2-2基因过表达对水稻抽穗期的影响

【目的】OsENO2-2是OsENO2通过可变剪切产生的短转录本,其cDNA序列从粳稻中花11中分离获得。本研究的主要目的是初步分析OsENO2-2在水稻抽穗期调控中的作用。【方法】构建了OsENO2-2的超量表达载体,获得转基因植株,通过对表型的观察和统计,分析目的基因在过量表达条件下的功能,并利用反向遗传学方法验证该基因的功能。【结果】OsENO2-2过量表达导致水稻在长日照条件下的抽穗期推迟,而短日照条件下抽穗期无明显变化。通过qRT-PCR方法对水稻开花关键基因的检测发现,在长日照条件下,RFT1的表达量在超表达材料中显著下调,其他开花重要基因表达量在野生型和超表达材料中没有显著变化;而在短日照条件下,所有检测基因的表达量在野生型和超表达材料中均没有显著变化。【结论】在长日照条件下,OsENO2-2主要通过调控RFT1基因的表达来调控水稻抽穗期。

SV40TAg转基因小鼠模型的建立及其表达

为了建立中枢神经系统肿瘤小鼠模型,构建了大鼠神经元特异性烯醇化酶(ratneu-ron-specificenolase,NSE)基因启动子调控下的猿猴病毒40大T抗原基因(simianvirus40largeTantigengene,SV40TAg)转基因载体,通过受精卵雄原核显微注射的方法制备转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型;RT-PCR和Northern印迹检测转基因阳性鼠中SV40TAgRNA水平的表达及其组织特异性;免疫组化检测其蛋白质水平的表达。经显微注射共获得9只首代转基因阳性鼠(首建者,Founder小鼠),其中2例出生时即发生神经干细胞来源的肿瘤,其他Founder小鼠经繁育后共建立了5个SV40TAg转基因小鼠系,其中有4个系检测到SV40TAgRNA水平的表达且特异性地表达于脑组织,但未检测到蛋白质水平的表达。研究表明NSE启动子活性具有较强的组织特异性,并起始于小鼠胚胎发育期;SV40TAg具有明显的致癌作用,且SV40TAg诱发的神经系统肿瘤易造成转基因小鼠早期死亡。

非小细胞肺癌组织中NSE的基因表达及与患者临床特征的相关性分析

目的:分析非小细胞肺癌组织中神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因的表达及与患者临床特征的相关性。方法:2019年10月-2020年9月收治非小细胞肺癌患者129例,分别采集患者的病变组织与癌旁正常组织,以电化学发光法与聚合酶链式反应(PCR)测得血清NSE表达水平,根据患者血清NSE表达水平划分为高表达组与低表达组,依次比较不同表达水平患者的基础资料、生活习惯以及病情程度等,从而评价NSE表达与患者临床特征的相关性。结果:本组患者病变组织的NSE水平为10.4~82.3 ng/mL,平均(51.7±13.5)ng/mL;癌旁组织的NSE水平为4.3~15.9ng/mL,平均(10.1±3.2)ng/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,NSE高表达75例(58.1%),低表达54例(41.9%)。高表达组与低表达组临床分期、吸烟史、饮酒史、T分期、N分期与M分期比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:非小细胞肺癌病变组织NSE基因呈高表达表现,并且NSE基因表达与患者临床特征具有相关性,进而推荐NSE基因为其临床诊治及评估的参考生物学指标。

酵母ENO2上游激活顺序对酵母LEU2表达的影响

本文将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中编码烯醇化酶的基因之一ENO2的上游激活顺序嵌入穿梭质粒YEp13上酵母LEU2基因上游-405Hpa Ⅰ的酶切部位。LEU2为编码β-异丙基苹果酸脱氢酶基因。从而研究了酵母ENO2的上游激活顺序对酵母LEU2表达的影响。实验结果表明ENO2上游激活顺序不论正向或反向嵌入都激活LEU2的表达达四倍左右。有亮氨酸存在的条件下,LEU2的表达受到抑制。ENO2上游激活顺序在对LEU2表达的激活上并不受葡萄糖的诱导。提出了用ENO2上游激活顺序组建高表达系统的可能性。

猪附红细胞体重组酶介导等温扩增技术(RAA)荧光检测方法的建立

为建立一种准确、快速的猪附红细胞体检测方法,根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因保守序列设计特异性引物和探针,经过筛选优化反应条件,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的方法在39℃恒温条件下20 min内即可特异性地检出猪附红细胞体,与猪肺炎支原体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、非洲猪瘟病毒、健康猪血液无交叉反应,方法的最低检出限为1 copy/μL。用该方法对15份临床样本进行检测,结果阳性率为60%,与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的猪附红细胞体荧光RAA检测方法具有较好的敏感性和特异性,操作简便可应用于猪附红细胞体病的临床快速检测。