肺炎克雷伯菌烷基过氧化氢还原酶C的表达纯化及其活性测定

目的表达、纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)烷基过氧化氢还原酶C(Alkyl hydroperoxide reductase C,Ahpc)并测定其活性。方法利用Clustal Omega分析不同细菌Ahpc蛋白的同源性;利用生物信息学方法分析肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白的生物学特性。根据Ahpc基因,设计PCR引物,以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,PCR扩增Ahpc基因,双酶切后将其连接到pET28a,获得重组质粒pET28a-Ahpc。将重组质粒转化大肠埃希菌,使用IPTG诱导重组Ahpc蛋白的表达,使用亲和层析纯化目蛋白,采用氧化铁二甲酚橙法测定Ahpc蛋白降解叔丁基过氧化氢活性。结果肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白含有两个半胱氨酸的经典过氧氧化还原蛋白,定位在细菌细胞质,无跨膜结构域。其α螺旋、β片层以及无规卷曲的含量分别为27.8%,19.7%和52.4%。三级结构是由10个同源的Ahpc蛋白组成同源多聚体。Ahpc蛋白具有多个B细胞表位。PCR扩增得到564bp的Ahpc基因,构建的pET28a-Ahpc重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后能表达分子质量单位约为24.7ku的重组Ahpc蛋白。亲和层析法获得纯度较高的重组Ahpc蛋白,纯化的重组蛋白能降解丁基过氧化氢。结论成功表达了肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白,该蛋白纯化后仍具有降解能够降解丁基过氧化氢的活性,为肺炎克雷伯菌的抗氧化机制研究奠定了基础。

NADPH-细胞色素C还原酶参与Graves病甲状腺过氧化氢生物合成

目的 :探讨NADPH -细胞色素C还原酶 (CR)在Graves病甲状腺过氧化氢 (H2 O2 )生物合成中作用。方法 :应用高香草酸荧光分析等技术测定Graves病和正常甲状腺H2 O2 浓度和CR活性 ,观察CR活性变化对H2 O2 合成的影响。结果 :Graves病甲状腺CR活性和H2 O2 水平均明显高于正常而H2 O2 酶活性无改变。加CR抑制剂对氯汞苯甲酸后 ,Graves病和正常甲状腺CR活性降低 84% ,同时H2 O2 水平下降近 5 7%。H2 O2 水平随CR活性降低而降低 ,两者呈显著正相关。结论 :CR参与Graves病甲状腺内H2 O2 生物合成 ,是甲状腺内H2 O2 生成的重要途径。

具杀虫活性的2-羟基-3-烷基-1,4-萘醌类化合物:辅酶细胞色素C氧化还原酶(络合物Ⅲ)与杀虫活性的相关性

Fieser和其同仁首次报道了2-羟基-3-烷基-1,4-萘醌类化合物的生物活性,指出拉帕醇和氢化拉帕醇对鸭子疟原虫(Plasmodium lophurae,用于筛选潜在的抗疟原虫药物)表现出有效活性。有相对亲脂性的取代基在3-位上对拉帕醇同系物进行取代合成,结果发现了新抗疟原药物atovaquone,并介绍了它对细菌、真菌、寄生原生动物、肿瘤细胞。

水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种非寄主互作体系中病原细菌过氧化氢的作用

【目的】探讨互作体系中病原菌来源过氧化氢的作用。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种互作体系中的过氧化氢积累的定位。【结果】突变体菌株细胞中烷基过氧化物还原酶亚基C的缺失导致胞内其余过氧化氢清除酶活性的补偿性显著上升,使胞内内源过氧化氢积累水平显著下降,并引起病原菌与水稻互作体系中的过氧化氢积累水平发生显著变化。【结论】病原细菌很可能是互作体系中过氧化氢的一个重要来源。病原细菌产生的过氧化氢很可能在非寄主互作中造成细菌周围植物细胞的损伤,对植物细胞具有潜在的毒性。

NADPH-细胞色素C还原酶对碘有机化的影响

目的 :探讨NADPH 细胞色素C还原酶 (CR)在碘有机化中的作用。方法 :应用荧光分析和同位素技术测定甲状腺H2 O2 浓度、CR活性和蛋白结合碘 (PBI) ,观察CR所引起的H2 O2 变化对PBI形成的影响。结果 :Graves病甲状腺CR活性高于正常 ,其H2 O2 水平和所形成的PBI亦明显高于正常 ;加CR抑制剂后 ,Graves病和正常甲状腺CR活性降低近 84 % ,同时H2 O2 下降近4 5% ,PBI形成随CR和H2 O2 水平降低而减少 ;而葡萄糖 /葡萄糖氧化酶系统可使PBI恢复正常。结论 :CR通过其所产生的H2 O2影响PBI的形成 。

空肠弯曲菌AhpC蛋白B细胞抗原表位预测及抗原性分析

目的利用生物信息学预测分析空肠弯曲菌AhpC的跨膜结构、信号肽及B细胞抗原表位,并分析空肠弯曲菌AhpC优势B细胞抗原表位的抗原性,为后续疫苗研究提供依据。方法使用TMHMM Server V2.0、SignalP 4.1、IEDB等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌AhpC进行蛋白跨膜结构预测、信号肽及线性B细胞抗原表位进行预测分析。分别以原核表达的空肠弯曲菌AhpC蛋白和化学合成的表位肽为抗原,空肠弯曲菌AhpC抗体为一抗,通过ELISA及Dot blot对优势线性B细胞抗原表位的抗原性进行分析及筛选。结果生物信息学预测结果表明AhpC定位于空肠弯曲菌外膜,无跨膜结构,无信号肽,同时该蛋白中存在7个的B细胞线性表位。经Dot blot和ELISA检测发现其中AhpC4-16表位具有较强的抗原性,为优势表位。结论空肠弯曲菌AhpC保守存在于细菌表面,存在1个优势的B细胞线性抗原表位(AhpC4-16),可用于后续的疫苗开发研究。

高温胁迫下罗非鱼源无乳链球菌的比较转录组分析

【目的】从分子水平了解高温季节罗非鱼无乳链球菌病容易暴发的原因。【方法】在35和28℃分别培养无乳链球菌,提取总RNA并进行转录组测序;利用华大基因Dr.Tom自主分析平台进行差异表达基因分析,并针对差异基因进行了KEGG通路和GO功能的分类和富集;通过实时荧光定量PCR随机检测10个基因的差异表达,确定转录组数据的可靠性。【结果】共得到35和28℃培养条件下的显著性差异表达基因357个,其中上调基因229个,下调基因128个;GO数据库富集能得到多个具有显著性的功能集,多集中在碳源代谢相关的途径,包括碳水化合物分解代谢过程(carbohydrate catabolic process)、糖原代谢过程(glycogen metabolic process)、细胞葡聚糖代谢过程(cellular glucan metabolic process)等;差异基因中发现了多个与无乳链球菌致病性相关的基因,如烷基过氧化氢还原酶亚基、cAMP因子、C5a肽酶等编码基因;实时荧光定量PCR与转录组数据间皮尔逊相关系数R值为0.979(P<0.001),说明转录组数据可靠有效。【结论】高温能够显著影响无乳链球菌碳源代谢相关的途径,可能通过加快菌体利用碳源而促进菌体的生长和扩散。高温也诱导了多个与致病性相关的基因出现上调表达,其中cAMP因子引起的细胞膜溶解和氧化还原酶类引起的免疫逃避可能是高温下无乳链球菌致病性增强的主要因素。

沙眼衣原体Ahpc蛋白的原核表达、纯化及活性分析

本研究根据Ct Ahpc基因序列设计特异性引物,以Ct DNA为模版PCR扩增Ahpc基因到大小为585 bp,将其连接到p ET28a获得重组质粒p ET28a-Ahpc,将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL/p ET28a-Ahpc,利用IPTG诱导重组Ahpc蛋白表达,目的蛋白分子量大小约为26 k D。利用Ni-NAT亲和层析法纯化得到的重组Ahpc蛋白。氧化铁二甲酚橙法检测发现Ahpc蛋白能够分解双氧水和叔丁基过氧化氢,具有分解过氧化合物的活性。测定重组大肠杆菌在百草枯所致氧化胁迫下的生长曲线,发现表达Ahpc蛋白的重组菌的生长情况比对照好。本研究成功表达和纯化得到沙眼衣原体Ahpc蛋白并测定其活性,为解析沙眼衣原体的抗氧化机制提供实验证据。