基于定向进化的烷基间苯二酚合酶改造

烷基间苯二酚合酶(ARS)属于研究蛋白结构与功能关系的模式分子——Ⅲ型聚酮合酶家族,其产物烷基间苯二酚是一种具有极其重要生物学功能活性的物质。为进一步提高ARS的酶活性,研究在成功实现ARS在大肠杆菌中进行温控自裂解异源表达的基础上,通过易错PCR及定点随机突变构建酶基因突变文库,并结合高通量筛选,获得酶活力显著提高的突变子ARSSd-3(A207S/M266A/T256S)。酶学性质研究发现:ARSSd-3的底物选择性向长链脂肪酰SNAC略有偏移;当以棕榈酰-SNAC为底物时,ARSSd-3的酶活力是ARS的1.55倍,米氏常数(Km)降低至(6.8±1.3)μmol/L,最大反应速率(Vmax)增加至(234.1±9.8)pmol/(min·nmol)。研究结果对探究ARS的催化机制及其生产应用具有一定意义。

新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的双控表达质粒构建及表达条件优化

利用化感物质开发除草剂是目前新型除草剂发展的一个重要方向。高粱素是高粱中分泌的一种化感物质,可对多种杂草的生长表现出显著的抑制作用。高粱烷基间苯二酚合酶（alkylresorcinol synthase,SbARS）是高粱素生物合成的关键酶。当以大肠杆菌Escherichia coli作为宿主进行SbARS的胞内表达时,细胞破碎是其中最为费时且最昂贵的步骤之一。本研究通过构建新型双控表达质粒p BM123-ars,实现了SbARS在大肠杆菌BL21（DE3）中的温控自裂解异源表达;在此基础上,通过优化诱导表达条件,可获得最高的SbARS酶活力（相对酶活力为160.04%±8.12%）及最高的裂解率（82.81%±3.14%）。研究结果可为新型除草剂高粱素的生物合成奠定理论基础。

多目标优化新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的异源双控表达

[目的]基于试验设计对高粱素生物合成关键酶-烷基间苯二酚合酶(Sb_ARS)的异源双控表达进行多目标优化。[方法]在前期成功进行Sb_ARS的温控自裂解异源表达的基础上,依次通过PB设计、最陡爬坡设计、响应面设计及线性加权多目标优化等方法,分析了11个与Sb_ARS在大肠杆菌中双控异源表达密切相关因素的影响。[结果]菌体培养时长、IPTG诱导时长和甘氨酸浓度对Sb_ARS酶活力和裂解率影响显著;当菌体培养时长为6.8h、IPTG诱导时长为4.6 h和甘氨酸质量浓度为1.0 g/L时,可获得总体最优Sb_ARS酶活力(117.12±0.13)%和裂解率(89.21±0.35)%。[结论]研究结果为新型除草剂高粱素的生物合成研究奠定理论基础。