一株印度洋深海食烷菌(Alcanivorax sp．P40)的烷烃羟化酶基因的克隆

以印度洋深层海水,用柴油和石油作为混合碳源经富集培养、分离获得一株具有很强的柴油降解能力的菌株P40.菌株P40革兰氏染色阴性,接触酶和氧化酶为阳性,能还原硝酸盐,不能还原亚硝酸盐.16S rDNA B lastn结果表明其与Alcanivorax dieseloleiB-5T(柴油食烷菌)及A.dieseloleiNO1A具有最高相似性,均为99.8%.菌株P40的gyrB序列与A.dieseloleiNO1A同源性也高达99.2%,而与A.dieseloleiB-5T只有86.9%.此外,从菌株P40中克隆到两个烷烃羟化酶alkB基因片断,分别命名为P40a-lkB1和P40a-lkB2.其中P40a-lkB1与报道的A.dieseloleiB-5T中的alkB同源性较高,达96.3%,而与同为深海来源的菌株NO1A的alkB的同源性更是达100%,P40a-lkB2则与A.borkum ensisSK2T(泊库岛食烷菌)的alkB1同源性最高,但仅为65%.

一株石油烃降解菌TY22烷烃羟化酶基因的克隆及功能研究

[目的]对一株石油烃降解菌TY22的烷烃羟化酶基因alkB克隆测序,并对其外源表达和功能进行研究。[方法]PCR扩增获得alkB基因部分序列,再根据该序列通过染色体步移技术,最终获得完整CDS序列。将alkB基因与pET21b(+)载体构建重组质粒,并转入E.coli BL21(DE3)进行表达。再将alkB基因克隆至pCom8载体中,分别转入E.coli GEc137(p GEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1进行基因功能的互补试验。[结果]染色体步移获得了1 236 bp的烷烃羟化酶基因完整CDS序列(Gen Bank Accession:KU867870)。诱导表达发现,重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳,得到与预期相符的46 kDa蛋白。基因功能互补试验发现,重组菌能在以C12~C16为唯一碳源的培养基中生长。[结论]TY22菌株的烷烃羟化酶基因完整CDS序列全长1 236 bp,能氧化C12~C16的中长链烷烃,并能在大肠杆菌中有效表达。

烷烃羟化酶基因alkB表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的构建烷烃羟化酶基因alkB表达载体并检测其在大肠杆菌的表达。方法体外合成alkB基因，选择烷烃表达载体pCom8，构建含alkB基因的重组质粒pCom8-alkB，并采用CaCl，法将其转入大肠杆菌DH5α中，通过十二烷基碘酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）检测不同诱导条件下的alkB基因表达的变化。结果构建的含alkB基因的重组质粒在DH5α中得到有效表达，且随诱导时问的延长而增加，在柴油诱导浓度为2％～3％（Ⅴ/Ⅴ）时，目的蛋白表达量相对较大。结论成功构建了含alkB基因的表达载体，阐明r不同诱导条件对目的蛋白表达的影响规律。

海洋烷烃降解菌Alcanivorax sp．A-11-3的分离鉴定及其降解酶基因研究

从马六岬海峡的表层海水中分离到一株石油降解菌A-1l-3．经16SrDNA Blast结果表明其与Alcanivorax borkumensisSK2具有最高相似性为96％，该菌可能是食烷菌属的一个新种．该菌具有很强的石油降解能力．结果表明，A—11—3对烷烃的降解范围较宽，能以C8～C36的烷烃为唯一碳源和能源生长；在7d内该菌对柴油的降解率达到49．5％．此外，还从菌株中克隆到了大小为426bp的烷烃羟化酶基因alkB片段和843bp的P450烷烃羟化酶基因的部分序列．序列分析表明，alkB片段编码的氨基酸序列与4．60rkumensis SK2^T的AlkB1和AlkB2的同源性分别为57．75％和40．14％；该菌的P450与SK2菌株的P450具有最高同源性，为87％．研究结果对于海洋石油降解微生物生态研究及石油污染生物修复技术开发有参考价值．

ALKBH5在肾透明细胞癌中的表达水平及临床意义

目的采用生物信息学方法探讨肾透明细胞癌(KIRC)组织中烷烃羟化酶同源5基因(ALKBH5)mRNA和蛋白的表达及临床意义。方法下载UCSC Xena数据库和癌症基因组图谱(TCGA)数据库中KIRC、乳头状肾细胞癌(KIRP)、嫌色细胞癌(KICH)的转录组测序(RNAseq)数据、临床病理参数和总生存期数据,并下载基因型和基因表达量关联数据库(GTEx)中对应的正常组织数据。比较KIRC组织及癌旁组织中ALKBH5 mRNA表达水平,分析ALKBH5 mRNA表达水平与不同临床病理学指标的关系;绘制ROC曲线分析ALKBH5 mRNA表达水平对KIRC的诊断价值;利用阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析数据库(UALCAN)分析ALKBH5蛋白表达水平与不同临床病理学指标的关系,比较ALKBH5 m RNA表达水平对患者预后的影响;利用LinkedOmics数据库行基因富集分析ALKBH5在KIRC中可能参与的信号通路。结果与癌旁组织相比,KIRC组织中ALKBH5 mRNA和蛋白均显著高表达(均P<0.05)。不同年龄、种族、病理分期、组织学分级、肿瘤发生部位KIRC患者组织中ALKBH5 mRNA表达水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。女性KIRC患者组织中ALKBH5mRNA和蛋白表达水平均显著高于男性患者(均P<0.05),A亚型KIRC患者组织中ALKBH5 mRNA表达水平显著高于B亚型患者(P<0.01)。酵母交换型转换/蔗糖不发酵(SWI/SNF)染色质重塑复合物突变组患者ALKBH5蛋白表达水平显著高于SWI/SNF复合物未突变组患者(P<0.01)。ROC曲线分析显示,ALKBH5 mRNA表达水平诊断KIRC的AUC为0.813,显著高于KIRP(AUC=0.605)和KICH(AUC=0.707)(均P<0.05)。相较ALKBH5 mRNA低表达组,ALKBH5 m RNA高表达组总生存率显著升高(P<0.01);男性KIRC患者ALKBH5 mRNA表达水平与预后无关(P>0.05),而女性KIRC患者ALKBH5 m RNA高表达组总生存率显著高于低表达组(P<0.05)。富集分析显示,ALKBH5 mRNA表达相关的基因可能参与糖酵解、果糖和甘露糖代谢、氨基酸生物合成等信号通路。结论ALKBH5 mRNA和蛋白表达水平在KIRC中具有较高的诊断、预后评估价值,可能通过糖酵解信号通路发挥作用。ALKBH5 mRNA可能成为判定KIRC患者预后的分子标志物和新的治疗靶点。

评价替莫唑胺对脑胶质瘤治疗敏感性的新方法

背景与目的:替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是治疗胶质母细胞瘤的唯一化疗药。O^6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子甲基化是评价TMZ敏感性的唯一指标。但通过检测MGMT的甲基化程度来评估TMZ的敏感性是不够的,因为目前MGMT检测只是定性检测,而且这种检测只能反映DNA损伤修复的一条通路,而另两条通路的修复情况却没有反映出来。方法:该研究一方面是应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM),对MGMT的甲基化进行定量检测,同时应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQPCR)来探讨另外两条修复通路蛋白N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶(N-methylpurine DNA glycosylase,MPG)和人类烷烃羟化酶基因同系物2(alkane hydroxylase gene homolog 2,ALKBH2)的mRNA表达。将MPG和ALKBH2的表达分为高表达和低表达。结果:结合MGMT的甲基化(阳性)和非甲基化(阴性)程度,再把MPG和ALKBH2结合起来评估患者对TMZ的敏感性。三阳性(MGMT非甲基化,MPG阳性和ALKBH2阳性)为化疗抵抗,两阳性为不敏感,两阴性为次敏感,三阴性(MGMT甲基化,MPG阴性和ALKBH2阴性)为最敏感。结合8例胶质母细胞瘤患者的检测和生存期,结果与我们的判断结果相吻合,三阴性的患者生存时间最长,三阳性的患者的生存时间最短。结论:通过定量检测MGMT同时结合MPG和ALKBH2可以更精准地判断TMZ的敏感性。

高效耐盐柴油降解菌的筛选、鉴定及降解基因

在辽河口湿地油田石油污染土壤中分离到一株耐盐柴油高效降解菌株L7,经过形态学观察、16S r RNA基因序列分析鉴定菌株L7属于不动杆菌属(Acinetobacter).该菌株能够以柴油、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷和二十二烷为唯一碳源和能源生长.在柴油无机盐培养基中,菌株的最适生长温度为30°C,最适pH值为7.0,菌株L7在pH 6.0~9.0,盐度范围为3%以内都可以生长.与其他的菌株相比较,菌株L7在柴油中生长更加迅速,在最适培养条件下培养4d后菌株的OD600nm就可以达到4.0,通过紫外分光光度法测定培养5d后,柴油的降解效率为61.5%.通过对菌株L7的全基因组测序和分析,在基因组上找到一个烷烃羟化酶基因alk B,将基因克隆到p ME6032质粒上,并电转至不依赖柴油生长的恶臭假单胞菌KT2440中,含有该质粒的KT2440菌株能够在柴油无机盐培养基中生长.GC-MS检测确定了菌株L7及其alk B基因对饱和烷烃的降解能力.推测菌株L7中烷烃降解途径为末端氧化途径,是由烷烃羟化酶催化反应生成相应的醇,最终通过β-氧化反应实现完全矿化.

一株来自大西洋表层海水的烷烃降解菌Gordonia sp. S14-10的分离鉴定及其降解相关特性的分析

【目的】本研究的目的是从大西洋表层海水分离筛选新的烷烃降解菌,了解其降解基因及降解特性,为海洋石油污染的生物治理提供材料。【方法】以柴油与原油作为混合碳源从大西洋表层海水样品中富集、并分离筛选出降解能力较强的烷烃降解菌。根据16SrRNA基因和其看家基因secA1序列确定其系统进化地位。分析了烷烃降解范围、表面活性剂产生能力及其他生理生化特性;利用已报道的兼并引物进行了烷烃羟化酶基因的PCR扩增及系统进化分析。【结果】分离筛选得到1株能够降解C10(C36直链烷烃的菌株S14-10。经16SrRNA基因序列系统发育分析表明它属于戈登氏菌属(Gordonia),与GordoniaterraeT同源性为99.86%,但secA1序列相似度仅为93.69%,可能为戈登氏属的一个新种。从该菌株中扩增得到了烷烃单加氧酶alkB和P450基因片段,它们与菌株Gordoniasp.TF6相应的基因序列具有最高相似度,分别为88.76%和99.61%。该菌能够产生糖脂类生物表面活性剂,将发酵液的表面张力降低到31.6mN/m。【结论】首次从大洋环境中发现了Gordonia属的烷烃降解菌,可能为该属的一个新种。菌株S14-10至少编码两套与烷烃降解相关的单加氧酶系统,对各种直链烷烃降解范围宽,能产表面活性剂,在海洋油溢污染的生物修复中有较好的应用前景。

高效石油烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.BZ-15)的筛选、鉴定及其降解性能研究

本研究旨在从土壤中筛选高效石油烃降解菌株，并对其系统分类和降解特性进行研究，为石油污染的原位修复奠定基础．该研究从滨州油井溢油污染土壤样品中分离得到一株高效石油烃降解菌株BZ-15，对菌株BZ-15进行形态观察、16SrRNA基因序列分析及系统发育树分析；对该菌株的生长特性进行研究；通过GC-MS分析其对原油组分中不同碳原子饱和烃的降解特性；同时研究吐温．20对其生长及降解特性的影响；对该菌株中的烷烃羟化酶基因alkM进行了克隆．结果表明，菌株BZ-15为不动杆菌属（Acinetobactersp．）细菌，在LB培养基中其代时为3．25h，添加吐温．20代时为2．67h，吐温．20可促进菌株BZ．15生长；该菌株可降解C13-c28碳链长度饱和烃，饱和烃降解率为61．O％，添加吐温．20饱和烃降解效率为52-2％，吐温．20可抑制菌株BZ-15降解饱和烃；菌株BZ-15存在烷烃羟化酶基因alkM，通过末端氧化途径对饱和烃进行降解．