应用PCR技术快速检测熊蜂短膜虫

【目的】近年来,熊蜂作为温室作物的理想授粉者在国外已被广泛利用,并且获得很好的经济效益和生态效益,所以国外熊蜂经常被进口用于设施农业。熊蜂短膜虫Crithidia bombi是熊蜂的一种重要寄生虫病,一旦随进口熊蜂传入,将给国内熊蜂蜂群带来严重危害,因此迫切需要建立一种熊蜂短膜虫检测方法。【方法】基于熊蜂短膜虫基因内转录间隔区(internal transcribed space,ITS)基因序列设计了一对引物(Cri-F/R),建立了熊蜂短膜虫的PCR检测方法,并对退火温度、引物浓度和循环个数等反应条件进行了优化,同时验证了该PCR方法的灵敏性、特异性和稳定性。【结果】以熊蜂短膜虫ITS基因保守区设计特异性引物建立的熊蜂短膜虫PCR检测方法是可行的。优化的PCR反应条件为:退火温度59℃,引物浓度0.5μmol/L,扩增循环数35次。对感染熊蜂短膜虫的熊蜂总DNA的灵敏度达到13.24×10-5ng/μL,并具有良好的特异性和稳定性。将该方法应用于熊蜂短膜虫的检测,整个检测过程不超过4 h,具有良好的适用性。【结论】研究建立了熊蜂短膜虫检测方法,能用于疫情监测和进境熊蜂的检验检疫。

我国不同地区熊蜂短膜虫的感染情况及亲缘关系

【目的】探明熊蜂肠道寄生虫——短膜虫(Crithidia bombi)的流行规律以及不同蜂种、不同地区间寄生的熊蜂短膜虫的亲缘关系。【方法】调查内蒙古、甘肃、青海、四川4个省(自治区)的25种1 007只熊蜂的短膜虫感染情况,对不同蜂种、不同地区间熊蜂短膜虫的感染率进行卡方检验(SPSS 22.0),并对熊蜂短膜虫的内转录间隔区ITS序列进行PCR扩增、克隆、测序。利用特异的ITS引物扩增待检测的熊蜂肠道总DNA,之后进行凝胶电泳检测,通过是否扩增出675 bp的熊蜂短膜虫ITS基因片段来判断待检测的蜂群是否感染了熊蜂短膜虫,再进一步测序,分析不同蜂种、不同地区寄生的熊蜂短膜虫之间的亲缘关系。【结果】在调查的所有样品中,有20种262只熊蜂被短膜虫感染,感染率为26.0%。感染率最高的两种熊蜂是白背熊蜂(Bombus festivus)和火红熊蜂(B. pyrosoma),而西伯熊蜂(B. sibiricus)的短膜虫感染率最低;青海省熊蜂的短膜虫感染率最高,而内蒙古熊蜂的短膜虫感染率最低;雄蜂的感染率极显著高于工蜂和蜂王。另外,除了甘肃省的黑尾熊蜂(B.melanurus)和猛熊蜂(B. difficillimus),四川省的疏熊蜂(B. remotus)、兴熊蜂(B. impetuosus)和弗里熊蜂(B. friseanus)所感染的短膜虫与其他短膜虫亲缘关系较远之外,其余大部分的熊蜂短膜虫的亲缘关系较近。【结论】熊蜂短膜虫对我国熊蜂的感染广泛,且不同蜂种、不同地理环境和不同级型间熊蜂短膜虫的感染率均有差别。熊蜂经过长期群体进化演变,不同地区形成相对固定的优势种类,因此各地区所捕捉到的熊蜂种类不同。对我国不同地区熊蜂短膜虫感染情况的统计分析侧重于样本量≥30的种类,这些种类是各地区的优势种类,另外一些熊蜂虽未能采集足够的样本,但根据已采集的样本量分析得出的感染率较高。熊蜂短膜虫存在寄主专一性,且对熊蜂宿主的感染具有适应性。我国部分地区熊蜂感染的短膜虫的亲缘关系总体来说较强,但也受到地理位置及其寄主熊蜂蜂种的影响。

不同株的熊蜂短膜虫与宿主生存的关系(英文)

ＴＨＥＲＥＬＡＴＩＯＮＳＨＩＰＢＥＴＷＥＥＮＤＩＦＦＥＲＥＮＴＳＴＲＡＩＮＳＯＦＣＲＩＴＨＩＤＩＡＢＯＭＢＩＡＮＤＴＨＥＳＵＲＶＩＶＡＬＯＦＴＨＥＩＲＨＯＳＴＢＵＭＢＬＥＢＥＥＳ不同株的熊蜂短膜虫与宿主生存的关系ＫｅｙｗｏｒｄｓＣｒｉｔｈｉｄｉａｂｏ...

熊蜂短膜虫(Crithidia bombi)微观进化的研究

从苏黎世和巴塞尔两个地理区域来源的熊蜂宿主（Ｂｏｍｂｕｓｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）中分离了４７个熊蜂短膜虫克隆。利用ＧＰＩ、ＭＤＨ、ＭＥ、６ＰＧＤ和ＰＧＭ五种等位基因酶电泳对这４７个熊蜂短膜虫克隆的检测结果发现，熊蜂短膜虫克隆间缺乏理论基因型，说明熊蜂短膜虫的自然群体存在着克隆结构。两个地理群体的熊蜂短膜虫的克隆结构也具差别。根据等位基因酶推测熊蜂短膜虫的染色体为双倍体。利用脉冲场梯度凝胶电泳，清楚地分离了熊蜂短膜虫的九条染色体规模ＤＮＡ带，其长度在不同地理群体的熊蜂短膜虫间都明显具有差别。实验证明，熊蜂短膜虫是由于地理区域宿主的隔离从古老的群体长期进化而来。

自然界熊蜂短膜虫的多克隆感染

利用等位基因酶电泳，对直接从宿主体内分离和克隆的40个熊蜂短股虫克隆进行了遗传变异检测。这40个熊蜂短股虫克隆分别从被两个蜂王感染的8只工蜂体内得到。共检测了GPI、MDH、ME、6PGD和PGM等五种酶。根据PGM，发现这40个熊蜂短股虫克隆中具有两种变异型。结果说明自然界中，熊蜂短膜虫存在着多重感染的现象。利用脉冲场梯度凝胶电泳，对熊蜂短膜央两种变异型的染色体规模DNA进行了比较，没有发现染色体规模DNA的区别。结合等位基因酶和染色体规模DNA电泳的结果，说明两种变异型的亲缘关系密切。对熊蜂短膜虫两种变异型生长曲线的比较结果，发现它们的增殖速度具有差别。

直接克隆熊蜂短膜虫的实验

对宿主来源的寄生原虫直接克隆,为调查自然界寄生原虫克隆的流行病学、生态学、遗传学及其宿主的关系等研究提供更准确的实验材料。为此我们对来源于宿主肠道的熊蜂短膜虫(Crithidiabombi)进行了直接克隆的实验。结果报道如下。

多重感染来源的两株熊蜂短膜虫(Crithidia bombi)在其宿主体内增殖的实验

利用自然界多重感染来源的两株熊蜂短膜虫（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａｂｏｍｂｉ）对熊蜂宿主（Ｂｏｍｂｕｓｔｅｒｅｓｔｒｉｓ）进行了感染实验。经过对宿主排泄物中熊蜂短膜虫Ａ、Ｂ两株及ＡＢ混合株的细胞计数和分析，发现宿主排泄物中熊蜂短膜虫、Ａ、Ｂ两株的细胞数具有明显差异。熊蜂短膜虫能在自然界中为区域性流行，不需媒介传播，增殖数量株间的差异将导致其在宿主体内的竞争和传播率的不同。虽然两株的增殖数量具有明显差异，但在自然界却普遍存在着两株共存的现象。结果提示，两株熊蜂短膜虫在同一宿主体内，它们的一些生物性指标可能发生交换。

多重感染来源的两型熊蜂短膜虫的生物学特征

对来源于多重感染的两型熊蜂短膜虫（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａｂｏｍｂｉ）的生物学特征实验分析表明，两型熊蜂短膜虫克隆的细胞分裂次数及建立克隆所需时间具有差别，其中Ａ型在克隆第３ｄ后，细胞分裂次数最少３次，最多６次；Ｂ型则最少１次，最多６次．建立克隆的时间为（当克隆的细胞在克隆板中分裂至１０７／ｍＬ，并且克隆孔中的培养液已加至２００μＬ时）Ａ型最短１１ｄ，最长１６ｄ；Ｂ型最短１０ｄ，最长２１ｄ．结果说明在多重感染的情况下，两型熊蜂短膜虫具有竞争行为．同时发现两型熊蜂短膜虫在４℃培养液中，其虫体表型具有明显差异。