熟地黄对帕金森病异动症模型大鼠纹状体内NMDA-R1、NMDA-R2和GABA-RB1表达的动态变化研究

帕金森病（PD）是一种神经变性疾病，由于黑质-多巴胺（DA）能神经元变性、坏死，导致黑质-多巴胺能神经元受损，引起直接通路-间接通路失调是其主要发病机制。本实验基于前期研究，通过检测大鼠脑内γ-氨基丁酸（GABA）受体和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体相关基因表达的变化，探索熟地黄治疗PD及左旋多巴诱导异动症（LID）的“增效减毒”机制。

RP-HPLC双波长法同时测定熟地黄中4种成分的含量

目的建立RP-HPLC双波长同时测定熟地黄中4种成分含量的方法。方法色谱柱为WatersSunfire C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈-体积分数0.2%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱;检测波长为λ1=210 nm和λ2=330 nm;流速为1.0 mL.min-1;柱温为30℃。结果梓醇、麦角甾苷、吉奥诺苷B1和马替诺皂苷质量浓度分别在125.0～2 000.0 mg.L-1(r=0.999 9)、11.0～176.0mg.L-1(r=0.999 9)、15.0～240.0 mg.L-1(r=0.999 9)和7.5～120.0 mg.L-1(r=0.999 8)内与峰面积呈良好的线性关系。加样回收率在97.5%～101.3%内。结论该方法灵敏,操作简便,结果可靠,可用于熟地黄药材的质量控制。

生、熟地黄缓解肾间质纤维化的作用及其机制研究

目的:探讨生地黄和熟地黄对单侧输尿管梗阻模型(UUO)大鼠肾间质纤维化的作用及其机制。方法:雄性SD大鼠随机分为生地黄水煎液组、熟地黄水煎液组、模型对照组、假手术组,每组5只。生地黄水煎液组、熟地黄水煎液组分别按生地黄、熟地黄剂量1.6 g/(kg·d)灌胃给药14 d,测定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。HE染色、Masson染色观察肾脏组织病理学变化,免疫印迹检测TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ的表达。结果:与模型组比较,各给药组大鼠Scr、BUN值显著降低(P<0.05);肾小球玻璃样病变减轻,肾小管囊性扩张和空泡变性程度缓解,胶原沉积减少,肾间质纤维化程度明显改善;TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达显著降低(P<0.05)。与熟地黄水煎液组比较,生地黄水煎液组的Scr、BUN值较低,胶原沉积较少,肾间质纤维化改善较明显,α-SMA表达显著减少(P<0.05)。结论:生地黄和熟地黄均能缓解肾间质纤维化,以生地黄作用较强,其作用机制可能与下调TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ的表达有关。

FTIR对酒炖熟地黄炮制终点的量化分析

利用红外光谱(FTIR)对酒炖熟地黄进行炮制过程和炮制终点评价分析。通过对熟地黄炮制过程中其整体红外特征吸收峰的变化趋势和变化规律来表征熟地炮制过程中其化学成分、生物形态(色味变化)及药学性质等的变化特点,最终利用熟地黄红外特征吸收峰(如1058、1026、817、797、777、1819、800及778 cm^(-1)等)和相关峰面积比(A1/A2)等多因素指标来量化熟地黄"黑如漆,甜如饴"之传统炮制经验,制定酒炖熟地黄"炮制终点"红外标准,规范熟地炮制工艺,保证熟地质量品质。

怀中1号地黄不同炮制品中脂溶性成分比较及体外抗氧化活性研究

目的比较怀中1号地黄不同炮制品(鲜地黄、生地黄和熟地黄)中脂溶性成分的差异,并初步评价其体外抗氧化活性。方法采用索氏提取法获得地黄3种炮制品的脂溶性提取物,采用气相色谱-串联质谱法对其进行成分分析。采用NIST98系统谱库自动检索组分的质谱信息,结合有关文献和与八峰索引、EPA/NIH库对照对化合物进行结构鉴定,并使用Hewlett Packard软件按峰面积归一化法计算各化合物的相对含量。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法考察3种地黄炮制品中脂溶性成分的抗氧化活性。结果从地黄不同炮制品中共鉴定出79个脂溶性成分,从鲜地黄、生地黄和熟地黄中分别鉴定出48、52和37个脂溶性成分,其相对含量分别占总成分的92.69%、86.29%、92.89%;三者中共有脂溶性成分20个,其相对含量分别占各炮制品中脂溶性成分含量的88.73%、80.89%、85.87%,且均以亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯、油酸甲酯等脂肪酸类成分为主。另外,鲜地黄中独有的脂溶性成分有18个,多为萜类化合物;生地黄和熟地黄中独有的脂溶性成分分别有17、6个,多为烷烃类化合物。抗氧化实验结果显示,三者中脂溶性成分对DPPH自由基的半数清除浓度分别为0.756、0.660、0.758 mg/mL。结论不同地黄炮制品中的共有脂溶性成分多为脂肪酸类化合物,鲜地黄中独有的脂溶性成分多为萜类化合物,生地黄和熟地黄中独有的脂溶性成分多为烷烃类化合物;其脂溶性成分均具有一定的体外抗氧化活性。

中风膏对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中Glu、NMDA-R1及海马神经元内钙离子浓度的影响

目的:在系统回顾缺血性脑卒中相关文献的基础上,通过大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型实验,探讨了中风膏对缺血性脑卒中引起再灌注脑损伤的治疗及作用机理。分析了中医益气活血法在缺血性脑卒中发病急性期用药的可行性、有效性、及安全性。方法:参照双侧颈总动脉夹闭法(2VO)及气虚血瘀的中医证型复制了缺血性脑卒中大鼠再灌注模型,造模成功后,予以中风膏灌胃治疗,阳性对照药选用益气活血,化瘀通络之步长脑心通。根据卒中评分标准,观察大鼠神经行为体征改变,分别测定相关指标。结果:本实验证明大脑神经元对缺血有不同的敏感性,其中海马区最为敏感,具有全脑缺血变化的全部特征。实验研究发现中风膏治疗组大鼠的神经行为体征较治疗前明显改善,中风膏组与阳性对照组疗效相当,均对缺血性脑卒中有很好的疗效。结论:本实验从细胞、分子水平探索认为中风膏治疗大鼠急性期缺血性脑卒中的机理可能是阻断脑缺血缺氧后的损伤级联反应,抑制兴奋氨基酸中Glu的释放,减少NMDA-R1的过度激活,减轻脑组织中Ca2+超载及脑缺血后引发的神经细胞毒性作用,从而保护脑组织,减轻脑组织的再灌注损伤,起到神经保护剂的作用。

熟地黄上调木糖基转移酶Ⅰ信号途径促进阴虚大鼠脑内γ-氨基丁酸合成的机制研究

目的基于木糖基转移酶Ⅰ(xylt-1)信号途径探讨熟地黄及其活性成分地黄苷D、梓醇对脑内γ-氨基丁酸(GABA)的调控机制。方法(1)将SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组(熟地黄组,30 g·kg^(-1)),每组8只,雌雄各半。采用辛温燥湿利湿中药复方(30 g·kg^(-1))灌胃诱导建立阴虚大鼠模型,早晚各1次,连续10 d。造模结束后,治疗组灌胃熟地黄水煎液,早晚各1次,连续10 d。测定记录大鼠体质量并通过旷场行为学实验检测其活跃度、穿格次数及总路程;采用ELISA法检测大鼠血清促性腺激素释放激素(GnRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平;qPCR法及全自动毛细管蛋白印迹法检测大鼠脑组织中xylt-1、多配体蛋白聚糖1(SDC-1)、早期生长反应因子1(EGR1)、谷氨酸脱羧酶1(GAD67)mRNA及蛋白表达水平;HPLC法检测脑组织中GABA含量。(2)采用siRNA沉默大鼠高分化肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的xylt-1基因,细胞分为正常组、阴性对照组、沉默组、沉默+地黄苷D(10μmol·L-1)组、沉默+梓醇(10μmol·L-1)组。采用qPCR法检测细胞中xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达水平;HPLC法检测细胞内、外液GABA含量;免疫荧光法检测细胞中SDC-1表达水平。(3)采用慢病毒转染PC12细胞过表达xylt-1基因,细胞分为正常组、阴性对照组(空载组)、过表达组。然后采用qPCR法检测细胞中xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达水平;HPLC法检测细胞内、外液GABA含量。结果(1)与正常组比较,模型组大鼠的体质量显著降低(P<0.01),活跃度显著升高(P<0.01),穿格次数及总路程显著增加(P<0.01);血清LH、FSH、GnRH、CRH、TRH水平均显著升高(P<0.01);海马及大脑皮层组织中的GABA含量明显降低(P<0.05,P<0.01);脑组织中的xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA(海马、大脑皮层组织)及蛋白(下丘脑、大脑皮层组织)表达均显著下调(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,治疗组大鼠经熟地黄干预后的体质量明显升高(P<0.05),活跃度显著下降(P<0.01),总路程明显缩短(P<0.05);血清LH、FSH、GnRH、CRH、TRH水平均显著下降(P<0.01);海马及大脑皮层组织中的GABA含量明显升高(P<0.05,P<0.01);脑组织中的xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA(海马、大脑皮层组织)及蛋白(下丘脑、大脑皮层组织)表达均显著上调(P<0.05,P<0.01)。(2)与阴性对照组比较,沉默组细胞的xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达显著下调(P<0.01);细胞内、外液中的GABA含量明显降低(P<0.05,P<0.01);细胞中SDC-1表达显著下调(P<0.01)。与沉默组比较,沉默+地黄苷D组细胞的xylt-1mRNA表达上调,但差异无统计学意义(P>0.05),沉默+梓醇组细胞的xylt-1 mRNA表达明显上调(P<0.05);沉默+地黄苷D组、沉默+梓醇组细胞的SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达显著上调(P<0.05,P<0.01),细胞内、外液中的GABA含量显著升高(P<0.01),细胞中SDC-1表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。(3)与正常组及阴性对照组比较,过表达组细胞的xylt-1 mRNA表达显著上调(P<0.01)。与阴性对照组比较,过表达组细胞的SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达显著上调(P<0.01),细胞内、外液中的GABA含量显著升高(P<0.01)。结论脑内可能存在调节GABA合成的xylt-1/SDC-1/EGR1/GAD67通路,熟地黄可能通过上调该通路提高脑内GABA水平。

基于代谢组学分析不同蒸制次数熟地黄中糖类成分的变化规律

目的：基于代谢组学技术研究不同蒸制次数的熟地黄中糖类成分的变化规律。方法：收集采用传统方法加工的第1蒸至第9蒸熟地黄样品,分别对其水提液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生及LC-MS测定。采用SIMCA-P 13.0软件进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）,得到差异标记物,通过多级质谱离子碎片及对照品比较对差异标记物进行鉴定。结果：经OPLS-DA共鉴定了6种糖类化合物,分别为甘露三糖、蜜二糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖;其中甘露三糖和蜜二糖逐渐降低,在第9蒸熟地黄中相对峰面积最低,分别为0.60和0.52;阿拉伯糖逐渐升高,在第9蒸熟地黄中相对峰面积达到4.74;甘露糖先升高后降低,其相对峰面积在第5蒸熟地黄中最高,达3.33;而葡萄糖和半乳糖基本上处于稳定状态。PCA结果显示第1蒸至第9蒸熟地黄沿着PC1轴逐渐改变,糖类代谢物发生着显著变化。结论：不同蒸制次数的熟地黄样品中糖类成分差异较大,可为九蒸九晒熟地黄的质量评价提供实验依据。

九蒸九晒熟地黄化学成分研究

目的研究九蒸九晒熟地黄中的化学成分。方法采用体积分数70%丙酮回流提取,提取物反复利用大孔吸附树脂、十八烷基硅烷键合硅胶填料(ODS)、硅胶及半制备液相等多种色谱方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质及波谱特征确定化合物的结构。结果从熟地黄体积分数70%丙酮提取物中分离得到21个单体化合物,根据其NMR图谱数据结合文献资料,确定21个化合物分别是p-hydroxyphenethyl-O-β-D-glucopyranoside(1)、phenylethyl-O-β-D-glucopyranoside(2)、1'-O-香草酰基-β-D-葡萄糖苷(3)、adoxoside(4)、darendoside B(5)、京尼平苷(6)、8-表番木鳖酸(7)、脱咖啡酰基毛蕊糖苷(8)、毛蕊花糖苷(9)、异毛蕊花糖苷(10)、2-(3,4-二羟苯基)-乙醇β-D-吡喃葡萄糖(11)、ferruginoside B(12)、kankanoside F(13)、leucoseceptoside A(14)、purpureaside C(15)、jionoside A1(16)、rehmaionoside C(17)、2-(4-羟基苯基)-2-氨基乙醇(18)、2,3-二羟基苯甲酸(19)、间苯三酚三甲醚(20)和香草乙酮(21)。结论从熟地黄中分离得到的21个化合物均为已知化合物,且化合物2~3、12~13、18~21是首次从地黄中分离得到。

基于HPLC-UV-DPPH法的地黄和熟地黄药材抗氧化活性成分比较研究

目的建立HPLC-UV-DPPH在线分析方法,比较不同生产企业的地黄药材在炮制前后抗氧化活性成分的变化,为中药炮制及质量控制提供有效的评价方法。方法 HPLC-UV-DPPH在线联用筛选系统中HPLC流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脱,体积流量为1.0 m L/min,色谱柱为Aglient Extend C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30℃,检测波长334 nm,DPPH溶液体积流量0.5 m L/min,检测波长517 nm。以毛蕊花糖苷为阳性对照,通过"量-效"研究思路评价样品的总抗氧化活性及各成分对总抗氧化活性的贡献率。采用HPLC-FT-MS对药材中主要的抗氧化活性成分进行鉴定并比较药材炮制前后的差异。结果 HPLC-UV-DPPH方法检测到地黄中主要含有9个抗氧化活性成分,而熟地黄含有13个,地黄和熟地黄有8个共有抗氧化活性成分,地黄在炮制前后抗氧化活性成分明显不同,不同生产企业的样品中各抗氧化活性成分的活性差异较大。抗氧化活性贡献率较高的成分分别为玉叶金花苷酸、海胆苷、焦地黄苯乙醇苷A1/A2、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。结论 HPLC-UV-DPPH法稳定、灵敏、重现性好,适用于地黄和熟地黄中抗氧化活性成分的快速筛选和质量评价。

斜视性弱视猫发育过程中视皮层神经元NMDA-R1表达的免疫组织化学电镜观察

目的 研究不同发育阶段斜视猫视皮层神经元N 甲基 D 天门冬氨酸受体亚基 1(N methyl D aspartatereceptorsubunit 1,NMDA R1)在超微结构水平的表达与变化。方法 幼猫 11只 ,其中 6只猫在 2周龄行 1只眼外直肌断腱术产生单眼内斜。依动物处死时的年龄分为 3组 :3周龄组(斜视手术后 1周 ) ,2只正常和 2只斜视幼猫 ;5周龄组 (斜视手术后 3周 ) ,2只正常和 2只斜视幼猫 ;成年组 (6月龄 ) ,1只正常和 2只斜视性弱视猫。 3组动物均取初级视皮层组织进行冰冻切片 ,NMDA R1单克隆抗体标记后 ,分Ⅱ～Ⅲ层、Ⅳ层及Ⅴ～Ⅵ层各为一个区块行常规电镜染色切片 ,透射电镜观察。结果 (1)电镜下分析 32 8个视皮层神经元 ,发现 3组正常猫的视皮层神经元NMDA R1标记阳性细胞数均高于斜视猫 (χ2 =4 2 8,4 4 1,4 89;P <0 0 5 )。 (2 )共计数 132 0个NMDA R1阳性突触 ,显示正常猫发育过程中 ,视皮层Ⅱ、Ⅲ层神经元细胞膜上的NMDA R1受体突触数多于Ⅳ～Ⅵ层 ,且随年龄增长而增加 (F =3 2 8,P <0 0 5 ) ;斜视猫视皮层神经元细胞膜上的NMDA R1受体突触数 ,3周龄组与正常幼猫组差异无显著意义 (F =0 17,P >0 0 5 ) ,5周龄组和成年组均较正常猫组显著减少 (F =2 6 94 ,4 7 0 1;P <0 0 0 1)。结论 (1)

十一味参芪片质量标准的改进

目的:建立十一味参芪片质量标准。方法:采用TLC法对处方中当归和熟地黄进行定性鉴别;采用HPLC法测定了人参皂苷Rg_1、Re含量。结果:在TLC图谱中可检出当归等药材的特征斑点;测得人参皂苷Rg_1平均回收率为96.2%,RSD=1.0%;人参皂苷Re的平均回收率为98.1%,RSD=1.6%。结论:所采用方法准确、可靠,可行性及重复性好,能有效控制该制剂的质量。

基于数据挖掘、网络药理学和分子对接的中药治疗牙周疾病的用药规律与作用机制

目的 通过数据挖掘、网络药理学和分子对接探讨中药复方治疗牙周疾病的用药规律及其作用机制。方法 首先,数据挖掘搜索治疗牙周疾病的单味药材,并筛选活性成分及其作用靶点。然后,利用疾病靶点数据库下载牙周疾病发病机制相关的靶点,与中药复方的作用靶点去映射,获取被认为中药复方治疗牙周疾病的潜在靶点,并对潜在靶点进行基因本体功能和信号通路分析。潜在靶点再通过筛选获取治疗牙周疾病的关键靶点。最后,将活性成分与关键靶点进行分子对接。结果 治疗牙周疾病的中药复方中熟地黄、牡丹皮、当归、茯苓、金银花、山药、知母等药材的出现频率最高,筛选得到43个活性成分及其118个作用靶点,并与856个疾病靶点进行交集得到52个潜在靶点。潜在靶点可能参与的分子功能和生物学过程主要集中在维生素D生物合成过程和对RNA聚合酶Ⅱ调控,并涉及96条信号通路。52个潜在靶点通过网络拓扑参数分析,得到11个关键靶点。分子对接结果表明,活性成分与α-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、细胞肿瘤抗原p53(cellular tumor antigen p53,TP53)和丝裂原活化蛋白激酶-1(mitogen-activated protein kinase-1,MAPK-1)等关键靶点具有较好的结合活性。结论 中药复方可能通过抑制牙槽骨吸收、抗菌、抗炎和促进组织修复功能,从而发挥治疗牙周疾病的作用,为中药复方的有效治疗牙周疾病提供更加科学性的参考。

N-甲基-D-天门冬氨酸-R1不同mRNA构型在斜视性弱视猫视皮层的表达

目的 了解在视觉发育可塑期 ,NMDA- R1受体基因的 m RNA构型与斜视性弱视猫视皮层神经元细胞水平表达减少有关的。 方法 同胞正常猫和斜视性弱视猫各两对 (共 4只 )。采用一系列地高辛核酸分子探针做猫脑片原位杂交 ,检测 NMDA- R1不同 m RNA构型在视皮层的表达情况。 结果 与正常猫相比 ,NMDA- R1m RNA“Pan”探针和 R1- a,R1- b,R1- 1构型探针在斜视性弱视猫视皮层的表达显著减少 ,主要在第 层。 R1- 3构型的表达在斜视性弱视猫视皮层比正常猫增加 ,主要在第 - 层。 R1- 2和 R1- 4构型的表达在正常猫和斜视猫视皮层的差异不显著。 结论 斜视性弱视猫视皮层 NMDA- R1m RNA特异构型的转录抑制导致受体蛋白水平表达的改变。

复方阿胶浆质量标准提升研究

目的提升复方阿胶浆质量标准。方法基于中药复方制剂"整体鉴别"新模式,对复方阿胶浆中植物来源中药采用一板多鉴法,红参、党参使用同一供试品溶液、同一展开剂,采用对照品和对照药材双对照(红参使用人参皂苷Rg1对照品和红参对照药材;党参使用党参炔苷对照品和党参对照药材)进行鉴别;熟地黄、山楂使用2种供试品溶液、同一展开剂,采用对照品和对照药材双对照(熟地黄使用毛蕊花糖苷对照品和熟地黄对照药材;山楂使用牡荆素鼠李糖苷对照品和山楂对照药材)进行鉴别。对复方阿胶浆中动物药阿胶建立L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4种氨基酸含量测定。并采用一测多评法,以L-羟脯氨酸为内标,确定甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的相对校正因子并计算含量。结果建立了复方阿胶浆中植物药鉴别的"4-3-2-2"模式,即4味中药,3种供试品溶液制备方法、2种展开剂,2种对照物的双对照方法,斑点清晰且专属性强。建立了复方阿胶浆中动物药阿胶一测多评法含量测定,15批样品中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的质量浓度分别为2.73-3.37、4.61-6.99、2.64-3.97、3.58-4.46 mg/mL。以L-羟脯氨酸为内标建立的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的相对校正因子分别为0.651、0.958、0.857。采用t检验、相对偏差法和Pearson相关系数法对2种方法的含量测定结果进行比较分析,15批复方阿胶浆一测多评法计算值与外标法实测含量值无显著差异。结论建立了复方阿胶浆中植物药来源中药鉴别的"4-3-2-2"模式。对处方中动物来源中药阿胶建立了4种氨基酸的一测多评法含量测定。通过"一板、一测",达到"多鉴、多评"整体药味质量控制的目的,科学合理地提升复方阿胶浆的质量标准。