二噁英对非洲爪蛙细胞色素P450表达的影响

二英(TCDD)是一类毒性较强的环境污染物质.试验使用印记法定量检测了非洲爪蛙芳烃基受体(AhR)及其核内的转录因子(Arnt),细胞色素P450(CYP)中的CYP1A6 mRNA及CYP1A7 mRNA;用免疫反应检测了CYP1A蛋白质的表达.结果表明:TCDD的染毒没有引起AhR和Arnt表达量的增加,但引起CYP1A6 mRNA及CYP1A7 mRNA表达的极显著增加,以及CYP1A蛋白质的强烈表达;TCDD强烈诱发非洲爪蛙CYP1A,且存在质量浓度依存性,使用CYP1A作为环境危险性评价具有一定的可探讨性.

中间丝蛋白vimentin在非洲爪蛙嗅球发育过程中的表达及意义

中间丝蛋白vimentin在嗅球发育中作用还没有被阐明,本研究目的是探讨vimentin在嗅球发育中时空模式及其意义。选择23～63期幼年和成年非洲爪蛙,做包含嗅神经和嗅球的连续冰冻切片,切片厚20μm,然后进行vimentin和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色,荧光显微镜观察。结果显示,vimentin在发育早期开始表达,一直维持整个变形期及成年。在49期以前,脑室前脚附近的放射性胶质细胞可见呈直的平行状的免疫反应。在变形前期和变形期,嗅球的每一层均可见到vimentin免疫反应,在嗅小球及僧帽细胞层vimentin阳性的放射胶质突起形态上呈丛状。在成年脑室附近的颗粒细胞层vimentin染色强度占优势,这反映了其在不同发育期的功能。结果提示,vimentin阳性的放射性胶质细胞,在早期及变形期可能为嗅神经元轴突的进入和嗅小球的形成提供适应的环境。而在成年,这种激活的胶质细胞可能与嗅球保持很强的再生能力有关。

ETS1/2对非洲爪蛙胰腺发育的影响

目的:探讨ETS1/2对非洲爪蛙胚胎胰腺发育的影响。方法:设计并合成特异性抑制ETS1/2表达的反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO),通过显微注射的方法将MO转入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交和定量RT-PCR检测标志性基因的表达变化。结果:单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,共同敲降ETS1/2后会使爪蛙胚胎发育异常,胰腺标志基因表达上升,肠道标志基因表达下降,肝脏和胃标志基因无明显变化;胰腺标志基因ngn3、igf1、foxa1的启动子区存在ETS1/2的结合位点。结论:单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,敲降ETS1/2促进爪蛙胚胎胰腺发育,抑制肠道发育,对肝脏和胃的发育无明显影响。

异型一氧化氮合酶在爪蛙鼻粘膜中的分布(英文)

用还原型辅酶Ⅱ黄递酶组织化学和一氧化氮合酶（ＮＯＳ）免疫细胞化学技术研究了成年爪蛙（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）鼻粘膜ＮＯＳ的阳性结构。嗅上皮中嗅感觉神经元和支持细胞，以及固有层中的神经束、血管和粘膜下腺均呈还原型辅酶Ⅱ黄递酶阳性染色。在嗅上皮中，未见Ⅰ型或Ⅱ型ＮＯＳ抗体免疫反应阳性结构，但鼻内侧窦和内侧窦口顶嗅上皮中的嗅感觉神经元见有Ⅲ型ＮＯＳ强免疫反应。在固有层中，Ⅰ型或Ⅲ型ＮＯＳ免疫反应性存在于神经束和血管中，未见于粘膜下腺的腺泡中。结果表明，不同异型的ＮＯＳ存在于爪蛙鼻粘膜中，提示一氧化氮可能参与爪蛙的化学感觉活动。

变形期非洲爪蛙嗅觉系统胶质原纤维酸性蛋白和波形蛋白的时空表达

目的研究非洲爪蛙(Xenopuslaevis)在变形期(48～63期)嗅觉系统中胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(vimentin)的时空表达与特点。方法取发育48期(stage)到63期不同阶段幼蛙及成年蛙嗅觉系统组织,常规制成冰冻切片,选每张切片上同时包含鼻、嗅神经、嗅球的切片进行GFAP、波形蛋白等抗体的免疫荧光化学染色,用荧光显微镜观察、记录结果。结果非洲爪蛙进入变形期(48期)后,嗅神经呈GFAP IR强阳性反应,但在嗅球,仅嗅神经层为GFAP IR阳性反应,嗅小球(glomeruli)呈GFAP IR阴性反应;而波形蛋白IR阳性细胞的分布与GFAP IR阳性细胞相反,在嗅小球可见典型的波形蛋白IR阳性的放射状胶质细胞,而嗅神经却是波形蛋白阴性。结论发育过程中GFAP与波形蛋白免疫反应阳性细胞呈互补的方式分布在蛙嗅觉系统中,即GFAP IR阳性细胞主要分布在嗅觉系统的周围部分,而波形蛋白IR阳性细胞则主要分布在嗅觉系统的中央部分。

爪蛙视网膜中诱导型一氧化氮合成酶免疫反应物质的存在

借助Ⅱ和Ⅲ型一氧化氮合成酶特异性抗体对成年爪蛙视网膜中含ＮＯＳ的结构进行了免疫细胞化学定位研究。发现视杆和视锥细胞的视网膜杆，少数神经节细胞和无足细胞２的细胞体均含有ＮＯＳⅡ免疫反应物质，缪勒细胞呈现强的ＮＯＳⅡ免疫反应性，外神经丛层的神经突起亦含强的ＮＯＳⅡ免疫反应性。在视网膜的细胞结构中，未见ＮＯＳⅢ免疫反应性。该结果暗示由ＮＯＳⅡ产生的一氧化氮可能参与视觉传导的调节。

组蛋白去乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎发育及胚层分化的影响

目的:探讨组蛋白乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎早期发育以及三胚层分化的影响。方法:用400 nmol/L的曲古抑菌素A(trichostation A,TSA)处理2细胞时期的胚胎,观察胚胎发育的情况,并通过整体原位杂交的方法检测胚层标记基因的表达;通过显微注射组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)特异性的反义寡核苷酸(HDAC1MO)实现HDAC1基因的敲降,利用整体原位杂交检测胚层标记基因的表达。结果:TSA处理造成胚胎发育异常,TSA处理和敲降HDAC1影响胚层标记基因的表达。结论:组蛋白去乙酰化酶在胚胎早期发育的过程中参与胚层的分化。

ETS1对非洲爪蛙早期胚胎发育的影响

目的:通过在非洲爪蛙胚胎中过表达ETS1探讨该基因对爪蛙胚胎早期发育的影响。方法:将克隆PCR获得的ETS1全长片段连接到质粒上,获得pCS2+-ETS1质粒;利用RT-PCR和Western blot检测ETS1 mRNA和蛋白在胚胎发育不同时期的表达情况;显微注射ETS1 mRNA入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交、定量PCR检测胚层标志性基因的表达;通过Western blot检测过表达ETS1对细胞凋亡和增殖的影响。结果:ETS1从受精卵时期即已开始表达,在器官形成期表达增强,过表达ETS1抑制了细胞分化以及神经胚期中胚层和外胚层标志基因表达,凋亡相关蛋白表达增加,增殖相关蛋白无明显变化。结论:ETS1表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,过表达ETS1抑制了中胚层和外胚层发育,促进细胞凋亡但不影响细胞增殖。

结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响

目的 :探讨结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响。方法:利用实时定量RT-PCR和原位杂交方法检测结蛋白在胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射特异性反义寡核苷酸进行敲降,利用原位杂交和实时定量RT-PCR方法检测各胚层标志基因表达的变化。结果:结蛋白低水平表达起始于囊胚期,自神经胚期起表达量增加,在随后的发育阶段持续高表达;结蛋白敲降导致胚孔闭合延迟,胚层相关标志基因的表达受抑制。结论:结蛋白自囊胚期起表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,敲降结蛋白导致胚胎发育迟缓,胚层分化受抑。

双酚A替代品与双酚A对非洲爪蛙急性毒性及其应激响应的比较

双酚F(bisphenol F, BPF)和双酚AF(bisphenol AF, BPAF)作为双酚A(bisphenol A, BPA)的替代品已被投入生产和使用,然而目前有关BPA替代品毒性的数据还很缺乏。本文从急性毒性和应激响应2个方面比较了BPF、BPAF与BPA对非洲爪蛙蝌蚪的毒性。结果表明,48 h的半致死浓度(LC50)顺序为BPF(11.01 mg·L^-1)>BPA(7.54 mg·L^-1)>BPAF(2.87 mg·L^-1);对氧化应激水平的影响BPAF强于BPA,BPF与BPA相近;BPA和BPAF对热休克蛋白基因表达水平有影响,BPF没有影响。本研究提示,BPAF作为BPA的替代品,其毒性强于BPA,而BPF与BPA类似。

四溴双酚A和四氯双酚A对非洲爪蛙蝌蚪的毒性效应

四溴双酚A(tetrabromobisphenol A,TBBPA)和四氯双酚A(tetrachlorobisphenol A,TCBPA)作为阻燃剂被大量生产和使用,其毒性效应受到关注。相对鱼类和哺乳类动物,TBBPA和TCBPA对两栖动物的毒性数据还比较缺乏。本文研究了TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性,并比较了二者对氧化应激标记基因和凝血相关基因转录水平的影响。结果表明,TBBPA和TCBPA的48 h半致死浓度分别为4.31 mg·L^(-1)和3.99 mg·L^(-1);在无蝌蚪死亡浓度下,TBBPA和TCBPA均能显著影响蝌蚪体内典型氧化应激标记基因的表达,其中,对谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase)gst基因的影响最显著,TBBPA和TCBPA的效应相近;TBBPA和TCBPA对蝌蚪体内热休克蛋白的转录影响不明显;另外发现,TBBPA和TCBPA可导致蝌蚪产生凝血现象,同时凝血相关基因的转录水平被上调。综上可知,TBBPA和TCBPA对蝌蚪的急性毒性都为中毒,氧化应激效应也接近,但不引起热休克蛋白转录的变化。

APP代谢通路关键基因在非洲爪蛙早期胚胎中的时空表达

目的:Aβ的沉积是形成老年斑的主要原因,同时是阿尔茨海默病的主要病理标志物。Aβ形成来源于该病的主要致病基因淀粉样前体蛋白APP(Amyloid beta precursor protein;XB-GENE-479158;NCBI:Xl.8671),APP在非洲爪蛙早期胚胎时空表达图式目前还不清楚,之前的报道只在某些手术分离的组织中用RT-PCR的方法进行了研究,为进一步在爪蛙中研究这类基因在发育过程中的时空表达及可能的功能,展开了本研究。方法:本研究收集了第2期到第4期非洲爪蛙胚胎包括(卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经轴胚、尾牙期和蝌蚪期),通过整体胚胎原位杂交和半定量RT-PCR检测基因APP在胚胎发育不同时期的时空表达,用双荧光素酶报告基因系统检测APP启动子活性。结果:APP有2种主要的转录产物,短的693~694个氨基酸,长的有750~751个氨基酸,主要差别来自外显子7的可变剪切。其中短的剪切体是主要转录的产物,而长的一个剪切体则表现为持续的低表达。整胚的原位表达结果显示:在神经板阶段,APP主表达在孵化和黏液腺中。神经管闭合后,APP转录水平升高,在体细胞中胚层,前肾和背侧神经管中呈现高表达。在尾芽末期,APP在晶状体、端脑、松果体、间脑和背侧耳泡中表达。在蝌蚪期,APP主要在包括胰腺、胃和十二指肠在内的消化系统中高表达。结论:APP是一个母源性表达的基因,其时空表达分布的特异性预示其在相关部位发育过程中可能发挥重要作用,从而为研究阿尔茨海默病的关键致病基因在胚胎早期的所发挥的作用提供了新的路径。

DNA甲基化修饰对非洲爪蛙胚层分化的影响

目的:探讨DNA甲基化修饰对非洲爪蛙三个胚层分化的影响。方法:用30μmol/L的5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZACdR)处理胚胎,抑制早期胚胎细胞内DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的活性,观察胚胎的表型,并收集原肠期胚胎通过原位杂交检测三胚层标记基因的表达情况;显微注射DNMT1特异的反义寡核苷酸(DNMT1MO)以敲降胚胎细胞内DNMT1的表达,然后通过原位杂交检测胚层标记基因的表达情况。结果:5-AZA-CdR处理导致胚胎早期发育异常,抑制中胚层标记基因Xbra的表达。敲降DNMT1促进背部中胚层标记基因GSC和Chordin的表达,抑制腹部中胚层标记基因Wnt8的表达。结论:DNA甲基化转移酶参与调节非洲爪蛙三胚层分化形成的过程。

非洲爪蛙与抗菌甾类化合物

非洲爪蛙与抗菌甾类化合物ＲｉｃｈａｒｄＳｔｏｎｅ著李大卫译何方淑校分子生物学家迈克尔·扎斯洛夫（ＭｉｃｈａｅｌＺａｓｌｏｆｔ），１９８９年７月，在缅因州的山地沙漠海岛生物实验室内，得到一个客座讲师职位之后，他观察到他所照管的星鲨在防护圈内作环绕游动。...

多壁碳纳米管分阶段暴露对热带爪蛙胚胎发育的毒性

近年来,碳纳米管(CNTs)的产量和使用量不断增大,提高了其释放到环境中的可能性.尽管碳纳米管的水生生态毒性有所报道,但对两栖动物胚胎的发育毒性研究仍比较少.本研究采用分阶段暴露的方式,以热带爪蛙胚胎的死亡率、孵化率、畸形率、畸形类型、心率、体长等作为毒性评价指标,研究不同浓度多壁碳纳米管(25、50 mg·L^-1)对爪蛙胚胎发育的胚胎毒性与敏感窗口.结果显示,多壁碳纳米管可导致爪蛙胚胎死亡率升高,孵化率降低,但对其心率、体长没有显著性影响(p>0.05).产生的畸形类型包括心腔水肿、脊索弯曲、泄殖腔畸形、眼睛畸形等,其中,心腔水肿占的比例最大为28.7%.另外,根据死亡率、孵化率、畸形率等指标综合评价爪蛙胚胎对多壁碳纳米管的敏感程度,由强到弱的顺序依次是:原肠胚期、囊胚期、神经胚期、尾芽期.研究表明,浓度为25 mg·L^-1和50 mg·L^-1的多壁碳纳米管对热带爪蛙胚胎发育具有一定的毒性作用,其作用机理与胚胎卵膜粘附碳纳米管有间接关系,研究结果可为合理评价碳纳米管对水生生物胚胎的影响提供一定的理论参考.

非洲爪蛙prmt5.L基因的克隆及时空表达谱分析

[目的]克隆非洲爪蛙prmt5.L基因并分析其在胚胎发育中的时空表达谱。[方法]收集胚胎,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异引物,PCR扩增prmt5.L基因的ORF序列,连接到p CS2+载体构建p CS2+prmt5.L重组质粒,连接位点为EcoRⅠ和XhoⅠ。经双酶切和测序验证成功构建p CS2+prmt5.L重组质粒。将p CS2+prmt5.L重组质粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶转录获得prmt5.L的反义探针。收集不同时期的爪蛙胚胎,固定并脱水后经原位杂交检测prmt5.L在胚胎发育中的表达情况。通过序列比对和进化树分析PRMT5在进化中的保守性。[结果]成功克隆非洲爪蛙prmt5.L基因,原位杂交检测了prmt5.L在早期胚胎中的时空表达谱。序列比对和进化树发现prmt5.L蛋白在进化中非常保守。[结论]成功构建了p CS2+prmt5.L重组质粒。prmt5.L基因在胚胎发育中呈现动态表达且prmt5.L蛋白在进化中非常保守。

C-cadherin控制非洲爪蛙早期胚胎中微丝骨架的合成

上皮细胞间形成的Adherens junctions复合物通过E-cadherin胞质区段,经由catenin家族蛋白介导,与细胞中微丝骨架系统(microfilament)相互作用,参与控制细胞极性、迁移,发育中的形态建成运动以及组织稳态维持等重要生命现象。多方面实验证据表明,cadherin复合物与微丝骨架系统的相互作用是高度动态的;作者前期的工作发现,在非洲爪蛙早期胚胎中,经典cadherin(C-cadherin)在细胞膜上的表达量决定细胞中微丝骨架合成总量。该研究进一步提供实验证据,表明随着囊胚期细胞增殖的进行,囊胚中期以后,细胞表面C-cadherin逐步富集,相应地细胞中微丝骨架的合成量也增加。我们还通过细胞解聚,C-cadherin敲降和过量表达,以及C-cadherin与F-actin共定位分析等实验验证在囊胚期外胚层细胞中,细胞膜C-cadherin表达量与细胞微丝骨架的合成量高度正相关。

热带爪蛙LAP家族基因在胚胎早期发育中的表达图式

LAP家族蛋白含有特征性的富含亮氨酸的重复序列和PDZ结构域.在脊椎动物和无脊椎动物中,LAP家族基因在细胞极性、上皮组织的动态平衡与肿瘤抑制等的调控中具有重要作用.在脊椎动物中,这一家族基因包括4个成员:densin,erbin,scribble和lano.本研究根据热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的基因组与EST序列,推测了其LAP家族的4个基因,克隆了其基因片段并研究了它们在胚胎发育中的表达图式.爪蛙的LAP蛋白在结构上与其他脊椎动物中的同源蛋白相似.这4个基因均有母源性表达,在卵裂期胚胎动物极细胞中表达较强,到原肠胚期在动物帽细胞中可检测到.在胚胎发育晚期,这些基因在上皮细胞中表达较广,包括神经上皮、耳泡、视泡和前肾.上述结果表明,LAP基因可能参与调控爪蛙早期发育中的上皮细胞极性和形态发生.在爪蛙胚胎头部,erbin和lano具有相似的时空表达图式,这表明二者在体内的功能可能是相关的.

不同粒径微塑料对三氯生在热带爪蛙蝌蚪体内积累分布及其生态毒性的影响

三氯生(TCS)作为药物和个人护理品(PPCPs)中常见的抗菌剂,在水环境中存在与聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)复合污染的生态健康风险.本研究旨在探究0.1、5、20μm PS-MPs吸附TCS在蝌蚪体内累积情况,以及对蝌蚪毒性的作用.结果表明,PS-MPs吸附TCS在蝌蚪体内的积累能力依次为:TCS+5μm PS组>TCS+20μm PS组>TCS+0.1μm PS组,累积量分别为3.27、1.8 mg·g^(-1)、无累积效应.值得注意的是,蝌蚪经不同粒径PS-MPs(2 mg·L^(-1))、TCS(1μg·L^(-1))单独及复合暴露7 d后,各实验组脂质代谢水平均表现出丙酮酸含量增加(p<0.05)、甘油三酯含量降低(p<0.05)的趋势.复合组中TCS+0.1μm PS组蝌蚪体内丙酮酸(Pyruvate)含量上升水平最显著(p<0.05);TCS+20μm PS组蝌蚪体内甘油三酯(TG)含量下降水平最显著(p<0.05),这可能与脂代谢调控基因ppar-α、cpt1-β表达水平显著提升有关(p<0.05).此外,PS-MPs、TCS单一和复合暴露还会增加蝌蚪体内CAT、SOD酶活性.与脂质代谢结果不同的是,复合组中TCS+5μm PS组蝌蚪体内CAT、SOD酶活性上升最显著(p<0.05),这可能与调控基因cat、sod表达水平显著提升有关(p<0.05).研究表明,复合暴露组对蝌蚪生理水平的影响高于单一暴露组,而不同复合处理组对蝌蚪脂质代谢水平和抗氧化水平影响具有差异,该结果可为评估微塑料(MPs)吸附亲脂性污染物对水生动物的毒性效应和生态风险提供信息和参考.

运用反义寡核苷酸研究非洲爪蛙母源基因的功能

母源基因在动物胚胎早期发育中的功能是发育生物学研究领域的难点之一。在过去二十多年里,反义寡核苷酸介导的反向遗传学技术在多种模式生物中均得到广泛应用,在非洲爪蛙母源基因功能分析中,反义寡核苷酸介导的mRNA降解和受体转移(host transfer)技术的联合使用,确立了以转录因子VegT和Wnt信号分子家族成员Wnt11为代表的母源基因在非洲爪蛙胚胎早期图式建成中的重要功能。目前,非洲爪蛙仍然是研究脊椎动物母源基因功能最为方便的模式系统,因此,该文将在简要叙述VegT和Wnt11调控胚胎三胚层的决定与分化和背方组织者中心诱导过程中的作用的基础上,较为详细地介绍反义脱氧寡核苷酸降解母源mRNA的原理和其与受体转移技术结合使用,分析非洲爪蛙母源基因功能的详细技术流程。