爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白1的结构和信号转导

爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)是具有致瘤潜能的疱疹病毒,与多种恶性肿瘤的发生相关。近年来,对EBV潜伏感染膜蛋白1(LMP1)的结构、功能及其介导的信号转导通路的研究取得了显著进展。作者就LMP1通过核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白1(AP-1)、双面联胎激酶(JAK)/信号转导和转录激活子(STAT)、Ets1、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/激活转录因子2(ATF2)途径和细胞周期依赖性激酶(Cdk)途径等,对细胞的生长、增殖、转化、分化、运动和凋亡的调控作一综述。

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2AcDNA的克隆及序列分析

目的 :克隆爱泼斯坦 巴尔病毒 (EBV)潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)基因 ,进一步研究其基因工程疫苗。方法 :用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出EBVB95 8株LMP2A全部编码蛋白的基因 ,并克隆至载体pGEM T中 ,通过α 插入失活、PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒 ;采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列。结果 :克隆出LMP2A第 1个外显子到第 8个外显子的全部编码蛋白的cDNA ,测序结果与EB病毒B95 8原型株LMP2AcDNA作同源比较 ,完全一致。结论 :本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。

HIV感染者体内Epstein-Barr病毒致癌性潜伏膜蛋白-1功能区C末端DNA序列分析

目的初步了解在HIV感染者体内,Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)致癌性潜伏膜蛋白-1(latent membrane protain-1,LMP-1)功能区C末端DNA特异性30bp缺失的发生率和33bp重复序列拷贝数的情况。方法采用巢式PCR扩增175例HIV感染者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)中EBV的LMP-1功能区C末端的基因片段,并进行核酸序列分析。为了避免核酸质量对实验成功率的影响,同时对提取的所有标本DNA的MDR1 C3435 T基因进行PCR扩增。结果所有HIV感染者的PBL标本中,MDR1 C3435 T基因均成功扩增(扩增率为100%),证明标本的DNA质量合格。175例标本中的33例可以成功扩增EBV-DNA(阳性率为18.9%)。在33例EBV-DNA阳性的标本中,27例(81.8%)的LMP-1基因核酸序列发生特异性30bp缺失(the 30bp-del),其33bp重复序列的拷贝数分别为4(4例,14.8%)、5(12例,44.4%)、6(8例,29.6%)、7(3例,11.1%);其他6例LMP-1核酸序列没有发生30bp核甘酸缺失,其33bp重复序列单位的拷贝数为4(5例,83.3%)、5(1例,16.7%)。结论 HIV感染者体内EBV致癌性LMP-1功能区C末端基因发生特异性30bp缺失的频率为81.8%,而其33bp重复序列的拷贝数为4、5、6、7,共4种。

EB病毒相关胃癌潜伏感染膜蛋白-1表达的研究

①目的探讨EB病毒阳性胃癌(EBVaGC)中潜伏感染膜蛋白-1(LMP-1)的表达状况。②方法原位杂交法检测胃癌患者石蜡包埋组织标本中EB病毒编码的小RNA(EBV encoded RNA,166bps,EBER-1);免疫组化法检测EBVaGC中LMP-1。③结果EBVaGC中无LMP-1表达。④结论EB病毒阳性胃癌中缺乏潜伏感染膜蛋白LMP1的表达。

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术，即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列，然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中，以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定，确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。

EBV潜伏膜蛋白-1表达与鼻咽癌增殖和凋亡关系的研究

目的:研究鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织中EBV基因EBER-1和LMP1的表达,凋亡相关基因Bcl-2和Bax,Fas和Fas-L,Caspase 3表达及其与p53蛋白的积聚、肿瘤细胞增殖和凋亡的关系。方法:分别用免疫组化染色、原位杂交和凋亡原位标记(TUNEL)技术研究NPC组织中EBV表达、凋亡相关基因表达、肿瘤增殖活性和凋亡活性。结果:87例NPC中,EBER1原位杂交(ISH)检出率为100％,EBV-LMP1阳性率63.2％(55/87),p53蛋白阳性率95.4％(83/87),肿瘤细胞Ki67核阳性率96.6％(84/87),鼻咽癌p53阳性强度与EBV-LMP1表达呈显著正相关(P<0.0005)。本组NPC病例Bcl-2和Bax阳性率分别为69.0％(60/87)和6.2％(57/87),Fas和Fas-L阳性率分别为87.2％(75/86)和54.7％(47/86),Caspase 3阳性率为62.1％(54/87)。NPC组织 Bcl-2的表达与Ki67的表达明显负相关(P<0.005),肿瘤细胞的增殖活性(Ki67的表达)与p53蛋白积聚显著正相关(P<0.0005)。Caspase 3表达与EBV-LMP1的表达呈负相关(P<0.001),但与Fas-L的表达呈正相关(P<O.025)。87例NPC组织凋亡指数(AI)值均数是87.5±65.5(TUNEL标记),肿瘤细胞凋亡活性与EBV-LMP1表达呈明显负相关,EBV-LMP1阳性的NPC组织AI值明显高于EBV-LMP1阴性组的AI值(P=0.0005);肿瘤细胞的凋亡与p53蛋白的积聚显著负相?

潜伏膜蛋白1介导IL-2Rα上调促进NK/T细胞淋巴瘤的形成和化疗耐药

背景与目的 NK/T细胞淋巴瘤(natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL)是一种高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤,经常发生化疗耐药。可溶性白细胞介素-2受体α(IL-2 receptorα,IL-2Rα)在NKTCL患者中血清水平升高,并与疗效和生存期显著相关。本研究旨在通过代表性细胞系中过表达IL-2Rα来探讨IL-2Rα的潜在作用。方法在人NK细胞系NK-92和NKTCL细胞系SNK-6中检测IL-2Rα的水平。使用慢病毒载体在NK-92细胞中表达潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1),以及在NK-92和SNK-6细胞中表达IL-2Rα,分析这些基因在增殖、凋亡、细胞周期分布和化疗敏感性中的生物学功能。结果 IL-2Rα在SNK-6细胞中的表达水平显著高于NK-92细胞。在NK-92细胞中表达LMP1可以显著上调IL-2Rα水平,而MAPK/NF-κB途径相关蛋白的选择性抑制剂可以显著下调IL-2Rα。在SNK-6细胞中IL-2Rα的过表达通过改变细胞周期分布促进细胞增殖,并诱导产生对吉西他滨、多柔比星和门冬酰胺酶的耐药,这些效应可以被抗IL-2Rα抗体逆转。结论我们的研究显示,在NKTCL细胞中LMP1激活MAPK/NF-κB途径,从而上调IL-2Rα表达。IL-2Rα过表达促进NKTCL的生长和化疗耐药,表明该白细胞介素受体可作为潜在的治疗靶点。

稳定表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1基因的鼻咽癌细胞系的建立

目的 :建立稳定表达鼻咽癌 (NPC)来源潜伏膜蛋白 1(LMP1)的鼻咽癌细胞系。方法 :利用基因重组技术构建NPC来源LMP1的一般性真核表达载体及上皮特异性表达载体 ,并将其转染鼻咽癌细胞系CNE - 2 ,用PCR、RT -PCR及蛋白印迹等检测N -LMP1在CNE - 2中的整合和表达。结果 :①成功构建了N -LMP1的一般性和上皮特异性表达载体。②N -LMP1基因在CNE - 2细胞中获得了正确表达。结论 :成功建立了稳定表达NPC来源LMP1的鼻咽癌细胞系 ,为进一步研究LMP1在鼻咽癌细胞中的作用机制奠定基础。

LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建EB病毒潜伏膜蛋白-1(LMP-1)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体。方法用PCR的方法从EB病毒阳性的鼻咽癌组织中调取EB病毒潜伏膜蛋白-1的基因,然后定向克隆到真核表达质粒pEGFP-C3上,以此构建成重组质粒pEGFP-C3-LMP1。结果经酶切及测序鉴定,确定已获得重组质粒pEGFP-C3-LMP1。结论在增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒中已成功克隆了EB病毒LMP-1基因。

鼻咽良恶性病变中EBV-LMP1、CyclinB1、P34^(cdc2)和Survivin的表达及意义

目的 :探讨P34cdc2 、CyclinB1和Survivin在鼻咽粘膜慢性炎、鼻咽癌和颈部淋巴结转移灶中的表达及意义 ,并分析与EBV LMP1表达的相互关系。方法 :应用免疫组化检测 30例鼻咽粘膜慢性炎、30例鼻咽癌和 30例鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中LMP1、P34cdc2 、CyclinB1和Survivin的表达。结果 :LMP1、P34cdc2 、CyclinB1和Survivin在鼻咽粘膜慢性炎中的阳性率分别为 2 0 .0 % (6 /30 )、10 .0 % (3/30 )、10 .0 % (3/30 )和 3.3% (1/30 ) ;在鼻咽癌中的阳性率分别为 6 3.3% (19/30 )、73.3% (2 2 /30 )、5 0 .0 % (15 /30 )和 36 .7(11/30 ) ,与鼻咽粘膜慢性炎比较差异均有显著性 (P <0 .0 1) ;在鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中的阳性率分别为 70 0 % (2 1/30 )、80 .0 % (2 4 /30 )、76 .7% (2 3/30 )和 4 3.3% (13/30 ) ,与鼻咽粘膜慢性炎比较差异均有显著性 (P <0 .0 1) ,与鼻咽癌相比较均有所增高 ,但仅CyclinB1有统计学意义(P <0 .0 5 )。在鼻咽癌及其颈部淋巴结转移灶中 ,LMP1与P34cdc2 和CyclinB1的表达均有显著相关性 (分别P <0 .0 1,P <0 .0 5 )。结论 :鼻咽癌中存在P34cdc2 、CyclinB1和Survivin蛋白过表达 ,LMP1与P34cdc2 和CyclinB1可能协同致病。

EB病毒潜伏膜蛋白1介导鼻咽癌细胞中转录因子Ets-1表达的实验研究

目的 探讨鼻咽癌 (NPC)细胞中EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)是否可介导转录因子Ets 1的表达。方法 采用受四环素 (Dox)调控的、LMP1表达的NPC细胞系 (pTet on LMP1HNE2 ) ,用Dox诱导LMP1表达 ,并检测Ets 1的表达。采用逆转录PCR(RT PCR)方法检测Ets 1RNA水平的变化 ;应用Westernblot方法检测Ets 1蛋白质表达情况 ;应用免疫共沉淀和Westernblot方法检测Ets 1磷酸化水平 ;应用EMSA方法检测Ets 1的DNA结合活性。结果 在不同诱导时间、不同浓度Dox诱导的pTet on LMP1HNE2细胞中 ,LMP1表达与Ets 1RNA表达、蛋白质表达、苏氨酸磷酸化水平及DNA结合活性在一定范围内呈正相关。结论 LMP1可介导NPC细胞中Ets 1的转录活化和表达 。

鼻咽癌组织LMP-1表达与外周血EBV-IgA/VCA的关系

目的研究鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)患者Epstein-Barr病毒(EBV)感染及潜伏膜蛋白1(la-tent membrane protein-1,LMP-1)表达的情况。方法采用免疫组化实验技术对62例鼻咽癌活检组织及33例慢性鼻咽炎组织中LMP-1的表达进行检测,同时采用免疫酶标法对这些患者外周血EBV的IgA/VCA抗体进行检测。结果外周血EBV-IgA/VCA检出总阳性率在NPC患者中为90.32%(56/62),在慢性鼻咽炎患者中为3.03%(1/33),两者之间差异具有显著性意义(P<0.05);LMP-1在NPC组织中表达的总阳性率为59.68%(37/62),在慢性鼻咽炎组织中表达的阳性率为6.06%(2/33),两者之间差异具有显著性意义(P<0.05);EBV-IgA/VCA与LMP-1共表达的患者占NPC患者总数的62.5%(35/56)。结论NPC患者外周血EBV-IgA/VCA表达与肿瘤组织中LMP-1阳性表达具有明显相关性;鼻咽癌发病与EBV感染明确相关。

EB病毒潜伏膜蛋白-1和环氧合酶-2及血管内皮生长因子C在鼻咽癌中的表达及其关系

目的:探讨血管内皮生长因子C(VEGF-C)、环氧合酶-2(COX-2)及EB病毒潜伏膜蛋白-1(LMP1)在鼻咽癌中的表达及其关系。方法:采用免疫组织化学法检测57例鼻咽癌组织中LMP1、COX-2及VEGF-C在鼻咽癌组织中的表达。结果:鼻咽癌组织中LMP1、COX-2及VEGF-C表达率分别为49.1%(28/57)、75.4%(43/57)和59.6%(34/57);经Spearman相关分析,它们之间呈相互正相关关系(均P<0.05)。结论:鼻咽癌中LMP1及COX-2可能直接上调VEGF-C表达,或者LMP1通过促进COX-2表达上调VEGF-C表达,从而对肿瘤的淋巴转移及发生发展起到促进作用。

LMP-1在胃癌和相应癌旁组织中的表达

目的探讨Epstein-Barr virus(EBV)感染与胃癌发生发展的关系。方法应用免疫组化SP法检测EB病毒潜伏感染膜蛋白-1(LMP-1)在97例胃癌组织及89例相应癌旁组织中表达。结果97例胃癌组织中30例LMP-1蛋白表达阳性,阳性率为30.9%,EBV阳性率与患者性别、浸润深度、淋巴结转移、组织学分型和临床分期之间无明显关系(P>0.05);89例相应癌旁组织中33例检测到EBV LMP-1的表达,胃癌组织及相应癌旁组织EBV阳性表达之间有显著相关性(P=0.000)。结论EBV感染与胃癌的发生有一定的相关性。

EB病毒的潜伏感染及其编码的癌基因在鼻咽非霍奇金恶性淋巴瘤中的表达及意义

目的:探讨鼻咽非霍奇金恶性淋巴瘤患者中EB病毒的感染情况以及在EB病毒潜伏感染状态下编码的病毒癌基因产物潜伏膜蛋白-1(LMP-1)与鼻咽部非霍奇金恶性淋巴瘤的发生及预后的关系,另外还对该组鼻咽淋巴瘤的组织细胞起源进行了分析。方法:我们选用EBER-1/2mRNA探针,经原位杂交方法检测了70例鼻咽恶性淋巴瘤和10例鼻咽慢性炎症病例中的EB病毒感染,同时使用免疫组化染色方法,分别标记了LMP-1、CD45RO、CD20及CD56阳性细胞。结果:EB病毒mRNA在鼻咽恶性淋巴瘤患者中的阳性表达率(62.9%)明显高于慢性炎症患者(0%)。LMP-1蛋白在上述两者间也有差异表达,肿瘤组(68.6%)高于炎症组(20.0%)(P=0.003)。本组有12例NK/T细胞淋巴瘤,特征性表达CD56,与LMP-1相关,但不具有特殊的生物学行为。LMP-1阳性高表达率除与鼻咽淋巴瘤患者出现临床B症状相关(P=0.043)外,与临床分期、出现区域淋巴结肿大均不相关,但LMP-1的表达与患者的预后密切相关,在死亡患者组中有LMP-1的高表达。结论:在鼻咽恶性淋巴瘤的发生、发展过程中,EB病毒的感染及其编码的癌蛋白LMP-1的产生起到了致关重要的作用。此外,LMP-1与不良临床特征和预后相关,同时还与CD56(+)的NK/T细胞淋巴瘤相关。

靶向LMP1基因siRNA作用对AP-1及其相关因子表达的影响

背景与目的:潜伏膜蛋白LMPl是EBV基因组BamH I Nhet片段上BNLF1编码的一种跨膜蛋白,它是发现最早的能在体外恶性转化细胞系的EBV潜伏期蛋白。本研字己旨在探讨LMP1沉默对AP-1信号转导通路及其下游与细胞转化、增殖和凋亡等相关因子转录表达的影响。方法:应用50 nmol/L靶向LMP1功能区编码序列的siRNA649转染EBV阳性的胃癌上皮细胞GT38,分别作用24、48、72、96、120 h,采用RT-PCR检测c-Jun,生存素,CDK4和MMP9 mRNA转录水平;免疫组化法检测细胞生存素蛋白表达;Western印迹法检测c-Jun,JunB和CDK4蛋白表达。结果:靶向LMP1特异性siRNA作用后,各时间点c-Jun和生存素mRNA水平均明显低于细胞对照组(P<0.05),c-Jun以24 h时降低最为明显,而生存素以48 h时降低最为明显;CDK4 mRNA水平均明显高于细胞对照组(P<0.05);转染后24、48、72 h时MMP9 mRNA表达水平均明显低于细胞对照组(P<0.05),96 h和120 h时MMP9则无明显改变(P>0.05)。与细胞对照比较,c-Jun和JunB蛋白表达均下调,JunB蛋白表达在作用第5天时有所恢复,CDK4蛋白表达均上调。免疫组化检测结果显示转染后细胞质中代表生存素阳性的棕色颗粒明显减少。结论:靶向LMP1功能区编码序列的siRNA转染可影响EBV阳性胃上皮细胞AP-1及其下游相关因子的表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

鼻咽癌组织中EB病毒潜伏相关基因的表达

目的:通过检测鼻咽癌组织中EB病毒的潜伏膜蛋白LMP1的序列以及LMP1、EBNA1、EBNA2的mRNA表达来探讨EB病毒的感染状态及其表达产物与鼻咽癌的关系。方法:应用PCR法检测鼻咽癌组织中LMP1 DNA的存在,并对鼻咽癌来源的LMP1和EB病毒永生化狨猴B淋巴细胞系B95-8来源的LMP1进行测序,比较序列的差异。利用巢式RT-PCR检测鼻咽癌组织中LMP1、EBNA1、EBNA2的mRNA表达。结果:47例鼻咽癌组织均含有LMP1 DNA,所有鼻咽癌来源的LMP1 DNA与B95-8来源的LMP1 DNA序列比较均存在着多个单核苷酸变异,最明显的是XhoⅠ酶切位点的丢失。测序后显示鼻咽癌来源的LMP1DNA有30个核苷酸的丢失。巢式RT-PCR显示LMP1、EBNA1、EBNA2在鼻咽癌中的mRNA表达率分别为76.6%、80.0%和74.5%。其中EB-NA1的表达是由Qp启动的,而B95-8细胞中EBNA1的表达是由Cp启动的。结论:鼻咽癌中EB病毒的作用途径比较复杂,LMP1、EBNA1、EBNA2等潜伏期基因还有早期裂解基因BARF1均可能参与鼻咽癌的发生发展过程。

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1对p53表达的调控

目的 探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)是否通过NF κB在鼻咽癌细胞中促进p5 3蛋白的表达 ,为阐明LMP1促进细胞凋亡的机制提供实验依据。方法 利用四环素诱导表达系统 ,建立受四环素调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系。用报道基因检测法和Western印迹技术 ,观察LMP1过量表达对NF κB的功能性活化及p5 3、bcl 2表达的影响。结果 在鼻咽癌细胞中 ,LMP1能活化NF κB。过量表达的LMP1促进p5 3基因的表达 ,这种促表达可以被硫代磷酸化修饰的LMP1及p6 5反义寡聚脱氧核苷酸阻断。LMP1和p6 5对bcl 2的表达则没有影响 ,LMP1过表达对bcl 2的表达无影响。结论鼻咽癌中LMP1通过活化核转录因子NF κB调节p5 3的表达 ;而在LMP1过表达时 ,bcl 2介导的抗凋亡机制未被启动 ,至少是未被上调的。

鼻咽癌中环氧化酶-2和潜伏膜蛋白-1的表达和相互关系的初步研究

目的:探讨鼻咽癌组织中的环氧化酶-2(COX-2)、潜伏膜蛋白-1(LMP1)的表达情况,同时分析了两者之间的关系。方法:53例鼻咽癌活检标本,8例鼻咽部慢性炎症常规石蜡切片标本作为对照组,用SP免疫组织化学法检测COX-2、LMP1的表达,采用SPSS12.0统计软件对实验数据进行统计。结果:在鼻咽癌组织中,COX-2阳性表达率为71.70%(38/53);LMP1阳性表达率为66.04%(35/53)。COX-2、LMP1的表达在颈部淋巴结转移组中均明显高于无颈部淋巴结转移组(P<0.05),但在年龄、性别、病理类型、临床分期的分组中均差异无统计学意义(均P>0.05)。在鼻咽癌组织中,LMP1和COX-2的表达存在正相关(γ=0.797,P<0.01)。结论:COX-2、LMP1在鼻咽癌组织中均有表达。COX-2、LMP1在鼻咽癌中的表达和鼻咽癌颈淋巴结转移存在显著相关性,但和年龄、性别、病理类型、临床分期无相关性。COX-2和LMP1在鼻咽癌组织中的表达呈正相关。LMP1可能通过多途径上调COX-2的表达,从而促进鼻咽癌颈部淋巴结转移。

EBV下调miR-34c促进鼻咽癌细胞增殖、迁移的作用及机制研究

目的:探究爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)下调miR-34c促进鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用及机制。方法:采用qPCR检测EBV阴性鼻咽癌SUNE1、CNE2、HK1细胞和EBV阳性C666-1细胞中miR-34c表达水平。构建miR-34c模拟物以分析miR-34c对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。使用CCK-8、划痕愈合试验以及Transwell细胞侵袭试验检测鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Western blotting测定细胞中迁移、侵袭相关蛋白以及Erk1/2信号通路蛋白的表达水平。结果:miR-34c在EBV阳性C666-1细胞表达下调(P<0.05)。CCK-8结果显示,miR-34c组C666-1细胞在16、24、48 h的活力明显低于EBV组(P<0.01)。划痕试验和Transwell试验结果显示,与miR-34c组比较,EBV组C666-1细胞迁移和侵袭能力均明显增强(P<0.01)。Western blotting结果显示,与miR-34c组比较,EBV组C666-1细胞迁移和侵袭相关蛋白Vimentin、Snail、MMP-2、MMP-3及Erk1、Erk2蛋白表达均明显升高(P<0.01)。结论:miR-34c在EBV阳性鼻咽癌细中表达下调,EBV下调miR-34c可增强鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移能力及激活Erk1/2信号通路。