片段长度差异等位基因特异性PCR—一种改良的SNP分型新方法

目的建立一种基于等位基因特异性PCR原理的改良SNP分型新方法:片段长度差异等位基因特异性PCR,并考察特异性引物的3'端第3位、第4位碱基错配对特异性延伸的影响。方法以SNP位点rs759117和rs760887为例,设计两条长度不同、3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时在两个等位基因特异性引物3'端第3或第4位碱基引入错配以增加特异性,下游为公用引物。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP纯合子为长度不同的单一谱带,杂合子则为两条带,其结果与直接测序完全一致。两条特异性上游引物3'端第3或第4位碱基引入错配后非特异性延伸显著减少,且对PCR反应条件的严格性要求明显降低。结论片段长度差异等位基因特异性PCR是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;两条特异性引物3'端第3。

消化后片段长度差异等位基因特异性PCR技术——印记SNP rs220028多态性和甲基化模式研究

目的建立一种能同时分析甲基化和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)的新方法。方法以印记SNPrs220028(A/G)为例,基因组DNA经甲基化敏感限制酶消化后用片段长度差异等位基因特异性PCR(fragmentlengthdiscrepantallele-specificPCR,FLDAS-PCR)分型;用扩增产物酶消化法来排除酶切位点序列变异,证实检出的是甲基化等位基因。结果消化后FLDAS-PCR可选择性检出甲基化等位基因,家系分析表明其来自母亲。等位基因频率A=0.5085,G=0.4915,多态信息含量为0.3749。结论消化后FLDAS-PCR技术可以实现甲基化和SNP的复合分析;印记SNPrs220028在Prader-Willi/Angelman综合征诊断中有潜在意义。

等位基因差异特异性PCR检测HBVDNA的前C区1896突变位点及其临床意义

为了探讨ＨＢＶ前Ｃ区 １８９６突变位点检测的临床意义，采用３－末瑞等位基因差异特异性ＰＣＲ方法对９５例乙型肝炎病毒感染者的ＨＢＶＤＮＡ１ ８９６位点进行基因型（野生株／突变株）的检测，结果显示：总突变率为６４．２％，总野生率为５５．８％，纯野生型和纯突变型的检出率分别为２８．４％和２７．４％；不同临床类型的乙肝病毒感染者均可出现突变，其野生型、突变型和混合感染型的检出率之间的比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５），急性乙肝与慢性乙肝、携带者、肝硬化和肝癌的总突变率存在差异（Ｐ＜０．０５）；血清不同ＨＢｅ系统均可发生突变．抗－ ＨＢｅ阳性组的突变率显著高于ＨＢｅＡｇ阳性和ＨＢｅ系统阴性组（Ｐ＜０．０５），提示：机体感染了ＨＢＶ后．变异主要是发生在慢性持续性感染过程中．突变株逐渐替代了野生株并成为优势株．使宿主得以持续感染ＨＢＶ。

联合应用参比DNA和新的重组抗原等位基因特异性细胞株进行免疫得知,针对胎儿同种免疫性血小板减少症的低频率人类血小板同种抗原的免疫不是单一事件

背景 胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）是由母亲的抗胎儿血小板同种抗原产生免疫所致。在低频率的血小板同种抗原所致FNAIT的情况下，实验室诊断往往由于缺乏足够的血小板而不能进行。研究设计和方法分析3位母亲有抗胎儿血小板抗原免疫的家族。在1号家族中，另1名女性被观察到以前曾发生过免疫。在2号和3号家族中，新生儿有典型的FNAIT的临床表现。应用多聚酶链反应一片段长度多态性进行了基因分型，

武汉汉族8个Y染色体双等位基因标记遗传多态性

目的筛选汉族群体中具有多态性的Y染色体双等位基因标记并研究其等位基因及单体群频率分布, 为法医学应用和群体进化研究提供基础数据。方法采用片段长度差异等位基因特异性PCR和PAGE技术对武汉地区160名男性汉族无关个体的8个Y染色体双等位基因标记(M9、M89、M111、M119、M122、M134、IMS-JST003305 和SRY+465)进行分型。结果 8个双等位基因标记在武汉汉族群体中均具有遗传多态性,其基因多样性(GD)范围为 0．0126-0．4830,共检出9种不同单体群(Hg1～9),其单体群多样性(HD)为0．7776。结论 8个Y染色体双等位基因标记组成的单体群在法医学应用和群体进化研究中具有一定的实用价值,可作为Y-STRs标记的有效补充。

日本血吸虫中国大陆株雌性特异性DNA片段及重复序列的分离与鉴定

目的 分离鉴定日本血吸虫基因组 DNA的雌性特异性片段及 DNA重复序列。方法 分别提取雌、雄日本血吸虫基因组 DNA ,制备检测子和驱动子 ;利用代表性差异分析 (RDA)及 PCR进行扣除杂交 ,获得目的 DNA片段 ;对所获目的 DNA片段用低熔点凝胶回收 ;转质粒载体、重组质粒载体的阳性克隆筛选、测序 ;用 Southern blotting对目的 DNA片段进行鉴定。结果 RDA及 PCR获得 5个目的 DNA片段 ;并转质粒载体测定了 5个目的 DNA片段 (P1～ P5 )的序列。 Southern blotting显示 DNA片段 P1和 P2均与雌、雄基因组 DNA强烈杂交 ;DNA片段 P3与雌性基因组 DNA的杂交强度明显高于与雄性基因组 DNA的杂交强度 ;DNA片段 P4和 P5仅与雌性基因组 DNA杂交 ,但不与雄性基因组 DNA杂交。结论 DNA片段 P1和 P2为日本血吸虫 DNA重复序列 ,并以多拷贝存在于日本血吸虫基因组 DNA中 ;DNA片段 P3存在于日本血吸虫性染色体 W和 Z上 ,在性染色体 W的拷贝数多于在性染色体 Z上的拷贝数 ;DNA片段 P4和 P5仅存在于日本血吸虫性染色体 W上 ,为日本血吸虫雌性特异性片段。

用等位基因特异性PCR／限制性片段长度多态性策略构建原发性青光眼致病基因CYP1B1的单倍型

目的建立等位基因特异性PCR／限制性片段长度多态性（allele-specific PCR／restriction fragment length polymorphism，AS-PCR／RFLP）法检测原发性先天性青光眼（primary congenital glaucoma，PCG）致病基因CYP1B1常见单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）及其单倍型的方法。方法收集20例原发性先天性青光眼患者和20名正常对照为研究对象，首先经测序筛查SNP位点后，再分别以PCR-RFLP和AS-PCR／RFLP策略构建CYP1B1基因rs10012（S1）和rs1056827（S2）及rs1056836（S3）和rs1056837（S4）位点的单倍型，并对这两种策略进行评价。结果测序共发现4个SNP位点，为第2外显子rs10012G／C（s1）及rs1056827T／G（S2）、第3外显子rs1056836C／G（S3）及rs1056837T／C（S4）。这些位点在PCG患者和正常对照中的分布呈现不同特点，同时存在rs10012（S1）和rs1056827（S2）位点的PCG患者和正常对照分别为10例（50％）和5人（25％）；同时存在rs1056836（S3）和rs1056837（S4）位点的PCG患者和正常对照分别为5例（25％）和2人（10％）；均未发现上述SNP位点单独存在。确定各位点的分布特点后，首先用PCR-RFLP策略构建rs10012（S1）和rs1056827（S2）位点单倍型，显示杂合突变型除出现目的条带外还存在底物条带，虽提示同时存在rs10012（S1）和rs1056827（S2），但仍不能证实存在位点间的连锁；AS-PCR／RFLP构建的结果显示，AS-PCR扩增rs10012（S1）位点获得阳性结果的同时，针对rs1056827（S2）位点的特异性RFLP分析也获得阳性结果。AS-PCR／RFLP对位点rs1056836（S3）和rs1056837（S4）的分析获得了类似的结果。应用AS-PCR／RFLP成功构建了C-GErs10012（S1）-rs1056827（S2）]和G-C[rs1056836（S3）～rs1056837（S4）]两种单倍型。结论应用AS-PCR／RFLP策略成功构建PCG致病基因CYP1B1单倍型，该方法准确高效特异可用于构建遗传性疾病基因的单倍型。

视网膜特异性Rho启动子的基因克隆与序列分析

目的:获取视网膜特异性表达Rho启动子基因,为实现外源基因在视网膜组织中特异性表达做准备。方法:用酚氯仿异戊醇抽提BLAB/c鼠全基因组DNA;设计引物,从基因组中通过PCR扩增获得视网膜特异性表达的Rho启动子基因;克隆入PcDNA3.1+载体,酶切、PCR鉴定,上海博亚生物技术公司测序;序列分析。结果:从BLAB/c鼠全基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段;构建重组PcDNA3.1+-Rho载体具有与目标片段长度相符的插入片段,插入方向正确;测序结果分析显示,视网膜特异性Rho启动子高度保守,所获得的BLAB/c鼠Rho启动子与Genebank报道的序列一致。结论:成功获得BLAB/c鼠Rho视网膜特异性启动子,为下一步研究视网膜疾病的发病机制和基因治疗奠定了一定的工作基础。

用FLDAS-PCR和PCR-RFLP检测汉族人群GPT的多态性

目的 建立片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR)检测GPT基因型的新方法,并调查武汉地区汉族人群GPT多态性分布。方法 应用FLDAS-PCR、PCR-RFLP分别对武汉地区248例汉族个体进行GPT基因型分型。结果 FLDAS-PCR与PCR-RFLP分型结果完全一致,GPT的3种基因型分型明确,基因频率GPT*1=0.5423,GPT*2=0.4577,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论 FLDAS-PCR和PCR-RFSP分型GPT在法医学鉴定中有实用价值。

细胞色素P450酶1A2和2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联分析

目的探讨细胞色素P450酶(cytochromeP450enzymes,CYP)1A2、2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增技术及限制性片段长度多态性(RFLP)测定79例难治性抑郁症患者及107名正常对照者CYP1A2C163A、CYP2C19G681A基因多态性。结果两组间基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=3.605,P>0.05;χ2=3.154,P>0.05)。难治性抑郁症患者对照组间基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=0.853,P>0.05;χ2=0.568,P>0.05)。79名患者中46名接受氟西汀合并小剂量利培酮(0.5～2.0mg/d)治疗,将其分为治疗有效组和无效组,两组间CYP1A2C163A(χ2=0.785,P>0.05;χ2=7.142,P>0.05)CYP2C19G681A(χ2=3.008,P>0.05;χ2=2.722,P>0.05)基因型及等位基因分布差异均无显著性。根据CYP2C19G681A基因多态性将患者分为无突变组(G/G型)和突变组(G/A型和A/A型),两组患者CYP1A2C163A基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=0.252,P>0.05;χ2=0.682,P>0.05)。结论CYP1A2C163A和CYP2C19G681A基因多态性与难治性抑郁症无显著关联,不是影响利培酮对氟西汀增效作用的主要因素。

病毒分离和PCR-RFLP法对急性结膜炎标本中腺病毒感染及其型别的分析

目的 分析2 0 0 3年下半年收集的哈尔滨医科大学第一临床医学院急性结膜炎标本中的腺病毒( Adenovirus,Ad V)感染情况及其型别。方法 采集5 9例临床确诊为急性结膜炎患者的结膜拭子标本,在观察和分析接种细胞的病变( CPE)情况的基础上,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析( PCR- RFL P)法,特异性检测CPE阳性细胞中腺病毒核酸的存在情况,并对PCR阳性扩增产物进行病毒型别的分析。结果 70 .7% ( 4 1/5 9)的急性结膜炎标本接种于培养细胞后可以引起明显的CPE;其中,5 3.6 % ( 2 2 / 4 1)的CPE阳性标本可以扩增出腺病毒核酸,RFL P分析证实6 8.18% ( 15 / 2 2 )的腺病毒感染为Ad3型,31.82 % ( 7/ 2 2 )的腺病毒感染为Ad7。结论2 0 0 3年下半年哈尔滨市急性结膜炎主要以腺病毒3、7型感染为主。提示结合病毒分离培养和PCR- RFL P方法。

一种大豆SNP分型新方法

单核苷酸多态性(SNP)在大豆基因组中分布广泛,SNP分型是大豆SNP遗传作图,关联分析、分子标记辅助选择等研究的重要技术。本文以Rhg4基因开发的5个SNP为例,介绍了一种大豆SNP分型的新方法-片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR)。采用AS-PCR原理,针对某个SNP位点设计2条相差4-5bp的特异引物和1个公用引物,PCR产物约100bp或150bp,2种等位基因型PCR产物相差4-5bp,在2个特异引物3′端第3和4碱基位置分别人为引入错配碱基来提高PCR特异性,通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可将纯合和杂合基因型检测出来。探讨了特异引物浓度和退火温度对Rhg4-1592扩增效果的影响,研究表明,可通过调整特异引物浓度和退火温度优化扩增效果。FLDAS-PCR对18份种质分型结果与PCR产物克隆测序法一致,表明本研究建立的FLDAS-PCR法是一种简便、快捷、新型的大豆SNP分型方法。

长牡蛎(Crassostrea gigas)17个EST-SNP标记的开发

利用长牡蛎已有的EST序列数据库,筛选得到候选SNP位点共计1140个。根据候选SNP位点共设计引物82组,通过片段长度差异等位基因特异性PCR(fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)的分型方法,在一野生群体中进行检测和验证,结果共有17个SNP候选位点显示多态性。研究结果表明,通过基于EST数据库的SNP开发,可以有效弥补某些海洋生物因基因组学滞后影响SNP标记开发的现状。

药物代谢酶CYP3A在中国肾移植人群的遗传多态性

目的:建立药物代谢酶CYP3A4、CYP3A5的多个等位基因分型方法,为进一步从基因水平研究CYP3A与机 体对药物反应的个体差异本质及其与药物代谢的相关性提供分子生物学实验方法;探讨药物代谢酶CYP3A在中 国肾移植人群的遗传多态性。 方法:用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性(PCR RFLP)法及特异性等位基因 扩增(PCR ASA)法分别建立了CYP3A的CYP3A4亚型三个新突变点(CYP3A4 4、 5、 6)及CYP3A5亚型的 CYP3A5 3基因分型方法,并对中国肾移植人群进行基因分型。 结果:CYP3A4 4、 5、 6、CYP3A5 3在中 国肾移植人群的基因频率分别为0.75%、0.76%、0.75%和27.83%;个体突变率分别为2/133、3/197、3/200和 55/115。 结论:研究结果提示,中国肾移植人群中CYP3A4 4、 5、 6、CYP3A5 3的存在可能使其表达的药 物代谢酶活性改变,从而影响药物在体内的代谢过程。

中国葡萄酒产区酒酒球菌种质资源遗传多样性分析

为了解我国葡萄酒产区酒酒球菌种质资源遗传多样性,对22株筛选自我国不同葡萄酒产区的乳酸细菌进行了种特异性聚合酶链式反应(species-specific polymerase chain reaction,PCR)分析、16S r RNA序列分析和扩增片段长度多态性分析(amplified fragment length polymorphism,AFLP)基因分型。种特异性PCR和16S r RNA序列分析表明22株分离株为酒酒球菌(Oenococcus oeni)。建立了O.oeni基于HindⅢ和MseⅠ为内切酶的AFLP分析体系,对16对引物组合进行了筛选,结果表明HT-MA、HT-MT、HT-MC、HG-MA、HG-MT、HC-MT为O.oeni AFLP分析的最佳引物组合,且实验重复性在98%以上。对O.oeni的AFLP分析结果显示:22株O.oeni分为3个簇群,且簇群间遗传相似性系数较小。所以,以HindⅢ和MseⅠ为内切酶的AFLP技术是研究O.oeni基因分型的有效方法,我国葡萄酒产区的O.oeni具有丰富的遗传多样性,O.oeni菌株间的遗传相似性系数不仅仅与其生态地理分布有关,可能还与其所处的微生态和其他因素有关。

DNA技术鉴定动物物种研究评述

文中对DNA技术用于动物物种鉴定常用的限制性片段多态(RFLP)、随机扩增片段长度多态(RAPD)、扩增片段长度多态(AFLP)、扩增片段限制性长度多态(PCR-RFLP)、物种特异性引物扩增和直接测序法等6种方法进行了介绍,并对其研究状况和方法的优缺点进行了评述,指出了DNA技术用于动物物种鉴定存在的问题及发展方向.

Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变的研究

目的探讨Leber遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变类型及特点。方法分别应用等位基因特异性PCR(MSP-PCR)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)联合DNA测序的方法,对12个家系中21位临床症状疑诊为LHON的患者及其19位无明显眼疾的母系亲属进行线粒体DNA检测。结果40例受检者中35例发生11778位点突变,2位成员有3460位点突变,有1例发现有4258位点突变(A→G)。结论11778是LHON患者常见的突变位点,3460突变少见,新发现的突变位点4258可能是新的继发突变或基因多态性。

广西壮族人群13个单核苷酸基因座遗传多态性

目的 采用荧光标记复合扩增单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）体系对广西地区壮族314名个体的13个SNP基因座进行等位基因频率调查，并评价其法医学应用价值。方法 选择13个常染色体双等位基因SNP基因座，应用荧光标记片段长度差异等位基因特异性复合扩增SNP分型体系，对广西地区壮族人群进行群体调查。结果 获得了广西地区壮族人群13个SNP基因座的等位基因频率，13个SNP基因座等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，杂合度位于0．2166和0．5478之间，多态信息总量位于0．2084与0．3750之间，13个SNP基因座累积个人识别几率和累积非父排除率均分别达到99．99％和87．71％。结论 用荧光标记复合扩增片段长度差异等位基因特异性PCR法可同时对多个SNP基因座进行分型；13个SNP基因座在法医学个人识别领域具有较高的应用价值。

黑龙江地区慢性阻塞性肺疾病与肿瘤坏死因子基因多态性的相关性研究

肿瘤坏死因子（TNF）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的气道炎症和肺功能损害中起重要作用。已知肿瘤坏死因子α（TNF-α）和TNF-β存在单核苷酸多态性（SNP）TNF-α-308G/A和TNF-β＋252G/A，影响TNF在气道内的表达，因而可能是COPD发病的分子机制之一。我们的研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）方法，分析黑龙江地区汉族COPD患者及健康人群的TNF基因多态性分布情况，探讨其多态性在COPD发病中的作用。

CYP1A1和CYP1B1基因多态性与RPL易感性

目的探讨CYP1A1、CYP1B1基因多态性与复发性流产(RPL)遗传易感性关系,为预防和治疗该病提供新靶点。方法本研究采用等位基因特异性PCR(As-PCR)和聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)方法,针对CYP1A1基因MspΙ酶切位点和CYP1B1 L432V多态位点,检测81例患有原因不明RPL病例组和98名有生育史健康女性对照组之间差异。结果 RPL组和对照组CYP1A1 MspΙ位点3种基因型m1/m1、m1/m2、m2/m2分布频率差异无统计学意义(χ2=0.335,P>0.05);CYP1B1 L432V多态位点3种基因型C/C、C/G、G/G在病例组和对照组分布差异有统计学意义(χ2=7.467,P<0.05);2组间C、G等位基因分布差异有统计学意义(χ2=9.129,P=0.003);G/G、C/G基因型与C/C基因型比较,RPL危险度分别提高2.620、1.954倍;等位基因G使RPL危险性增加2.038倍。结论 CYP1B1 L432V突变基因型增加RPL发病风险,尚不能认为CYP1A1基因MspI位点多态性与RPL易感性有关。