穿孔膜片钳技术在离子通道电流研究中的应用

目的:传统的全细胞膜片钳技术在离子通道电流的记录中存在机械稳定性差,对细胞的损伤大,以及胞内液的被渗析影响与细胞内信号转导和离子通道调控有关的第二信使物质的正常运行。而穿孔全细胞膜片钳技术应用二性霉素B或制霉菌素在细胞膜上形成特定的孔道,选择性地允许一些离子和大分子物质,从而使细胞内环境保持相对稳定,在一定程度上弥补了上述缺陷,实验成功率也相应提高。本文就穿孔膜片钳技术在全细胞离子通道电流记录中的应用进行探讨。

Amphotericin B在全细胞穿孔膜片钳技术中的应用研究

目的:为研究海德氏突触的电生理特性,建立用amphotericin B穿孔的膜片钳技术。方法:本文应用两性霉素B(amphotericin B)在小鼠脑干的calyx细胞上进行穿孔膜片钳技术的研究。结果:应用amphotericin B进行穿孔后,通道电流衰减现象显著变慢。Amphotericin B的最适浓度为400μg/ml。结论:本研究摸索出了一种稳定的穿孔膜片钳全细胞记录技术,可以更有效,更真实的反应神经元通道电流的电生理特性。为穿孔膜片钳技术在听觉信息传导和调控研究中的应用提供了基础资料。

全细胞膜片钳技术在神经元钙通道药理研究中的应用

全细胞膜片钳技术是研究离子通道和药物对离子通道影响的最重要的技术之一,但是由于其对实验技术要求高,对实验标本制备和实验环境、实验用溶液等条件均有严格要求等原因致使其在实际运用中较为困难。本文报告了运用全细胞膜片钳技术进行神经元钙通道药理研究的一些经验。

应用膜片钳技术研究豆腐果苷对hERG钾通道电生理功能的影响

目的:探讨豆腐果苷对hERG钾离子电流的影响及潜在心脏毒性。方法:使用稳定转染hERG基因的CHO细胞,通过全细胞膜片钳技术检测不同浓度豆腐果苷对hERG通道电流活动的作用。结果:豆腐果苷对hERG钾通道的IC50约为47μmol/L,比临床常规剂量下人体内峰浓度高1 000倍以上。结论:临床常用剂量下,豆腐果苷发生与hERG通道抑制作用相关的心脏安全性问题的可能性非常小。

一种改进的适用于膜片钳技术的海马神经元分离方法

目的探讨获得适用于膜片钳技术的单个海马神经元的方法。方法取3～6日龄Sprague-Dawley新生大鼠10只,应用酶消化及机械分离法,急性分离出大鼠海马神经元,通过倒置显微镜直接观察和全细胞膜片钳技术分别对分离得到的海马细胞的形态学和电生理学特征进行研究。结果急性分离所得海马具有锥形胞体的顶树突特征,立体感强。在全细胞膜片钳记录模式下可记录到全细胞电流及钠通道电流,该电流可被1μmol·L^(-1)的河豚毒素完全阻断。结论应用该酶消化及机械分离法急性分离的新生大鼠海马神经元形态和生理特性良好,适用于海马神经元的膜片钳研究。

全细胞膜片钳技术在视网膜神经元电压门控离子通道研究中的应用

了解视网膜各种神经元神经电信号特点、产生机制及影响因素 ,对从功能角度评价视网膜神经细胞培养状态和移植效果具有重要意义。本文介绍一种先进的电生理学研究方法———全细胞膜片钳法在视网膜神经生理学中的应用 ,以及通过该方法对视网膜神经节细胞、双极细胞。

应用膜片钳技术探讨阿霉素对骨肉瘤(OS-732)及其耐药细胞(R-OS-732)钙离子通道的影响

目的：应用全细胞膜片钳技术测定ＯＳ－７３２及Ｒ－ＯＳ—７３２两种细胞的反应钙离子通道的钙离子电流，同时测定阿霉素单独及与异博定共同作用对两种细胞钙离子电流的影响。结果；ＯＳ－７３２细胞的峰值电流为（－０．２３０６±０．０１）ｎＡ（ｎ＝１０），Ｒ－ＯＳ－７３２为（－０．３０１４９±０．０４）ｎＡ（ｎ＝１０），二者相比差异显著（Ｐ＜０．０５）。阿霉素单独作用，随阿霉素浓度的增大（１～１００μｇ／ｍｌ），ＯＳ－７３２细胞峰值电流由（－０．２０６６９±０．０９）ｎＡ降到（－０．１０７０３±０．０６）ｎＡ，降低幅度为４５．１７％。Ｒ－ＯＳ－７３２细胞的峰值电流由（－０．２８４３５± ０．０４）ｎＡ降至（－０．２３８７３±０．０３）ｎＡ，降低幅度为７９．１８％。异搏定单独作用，当异搏定浓度为ｌμｇ／ｍｌ时，ＯＳ－７３２细胞的峰值电流降低幅度为５７．４％；Ｒ－ＯＳ－７３２细胞的降低幅度为５０．８１％。当阿霉素浓度为１０μｇ／ｍｌ，加入浓度为１μｇ／ｍｌ的异博定时。对于ＯＳ－７３２细胞降低幅度为７３．４４％，而Ｒ－ＯＳ－７３２细胞则为９１．３２％。

全细胞膜片钳技术在遗传性长QT综合征和不明原因猝死中的研究进展

基因突变导致的心脏离子通道疾病被认为是引起不明原因猝死的首要死因,长QT综合征作为最常见的心脏离子通道疾病之一,其致病基因突变在各类SUD中被不断报道。利用全细胞膜片钳技术进行心脏离子通道功能验证对于评估基因突变的致病性、明确SUD死者的死亡原因、筛查SUD危险人群具有重要的法医学意义。对全细胞膜片钳技术的基本原理及其在长QT综合征的发病机制与不明原因猝死研究中的应用进行综述。

大鼠海马神经元急性分离和膜片钳方法的研究

应用酶消化及机械分离法分离出生10-15d的大鼠海马神经元,从形态学及电生理学方面鉴定细胞活性。结果表明,该法可获得形态和生理特性良好的单个海马神经元。用0.5 μ mol／L的TTX阻断Na+通道后,分别记录到典型的全细胞电压依赖性钾离子通道电流以及延迟整流钾通道电流。证实该方法适用于海马神经元膜片钳研究,对深入探讨药物和毒物对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要价值。

一种适用于膜片钳研究的豚鼠心室肌细胞急性分离方法

目的获得适用于心肌细胞膜片钳研究的单个心室肌细胞。方法应用酶消化和机械分离的方法分离出生25~30 d的豚鼠心室肌细胞,从形态学及电生理学方面鉴定急性分离的豚鼠心室肌细胞活性,在电镜下观察活性较好的豚鼠心室肌细胞形态学特点,并选用活性较好的单个心室肌细胞进行膜片钳钳制,记录心室肌细胞Ik电流。结果形态学方面：活性较好的心室肌细胞边缘整齐,横纹清晰,膜的弹性较好,立体感较强。电生理方面：选用活性较好的单个心室肌细胞记录出典型的Ik电流曲线。结论该法可获得形态和生理特性良好的单个心室肌细胞。该方法适用于心肌细胞膜片钳研究,对深入探讨药物和毒物对心肌细胞离子通道及信号转导机制的作用机制具有重要价值。

合成冰片对大鼠海马神经元GABA_A受体介导电流的作用

目的:研究冰片对培养的大鼠海马神经元GABAA受体介导电流的调控。方法:采用全细胞膜片钳方法。结果:在培养的海马锥体神经元上,给予GABA可引起一具有明显脱敏的内向电流(IGABA),此电流能被b icucu llin所阻断,说明该电流为GABAa受体所介导。冰片以open-channel b locker的方式抑制IGABA,且这种抑制作用是可逆的,即洗去冰片后,抑制作用迅速消失。结论:冰片可能通过抑制GABAA受体提高中枢神经系统的兴奋性而发挥其醒脑作用。

兔左室各层心肌细胞快钠通道特性的跨壁异质性

目的 :研究新西兰纯种大白兔左心室游离壁 3层心肌细胞的形态特征及其快钠通道电流 (INa)特性的异质性。方法 :采用胶原酶酶解法分离兔左室游离壁 3层心肌细胞 ,以全细胞膜片钳技术记录快钠电流的动力学特性。结果 :1兔左室游离壁 3层心肌细胞的形态特征相似 ;2 3层细胞的 INa I-V曲线均呈电压依赖性 ,形态轨迹一致。 3层细胞中 M细胞的 I-V曲线最低 ,心内膜和心外膜层的依次向上。INa峰值电流密度在 -2 0 m V时 M,Epi和 Endo细胞分别为 -3 1± 8、-16± 7和 -12± 2 p A/p F(n=12 cells) ,M细胞的 INa电流密度明显大于 Epi、Endo。 M细胞的INa稳态失活曲线在最左边 ,向右依次为 Epi和 Endo细胞 ,M的 INa失活最快。 3层细胞的 INa失活后恢复曲线无显著性差异。结论 :兔左室游离壁 3层心肌细胞的形态特征相似 ,INa的分布及动力学特性存在异质性 。

葛根素对大鼠心肌细胞L型钙离子通道的影响

目的 :观察葛根素对大鼠L型钙离子通道的作用。方法 :恒流Langendorff灌流 ,I型胶原酶解分离 ,全细胞膜片钳技术记录离子电流。结果 :2 .4mmol·L- 1葛根素可以抑制单个大鼠心室肌细胞L型钙离子通道电流 ,且成时间依赖性 ;葛根素可以促进L型钙通道电流 电压 (I V)曲线的上移。结论 :葛根素可以抑制大鼠心室肌细胞的L型钙离子通道电流 。

抗心律失常药物作用最佳靶点研究

目的:通过研究乌头碱、哇巴因致心律失常作用的离子靶点,揭示抗心律失常药物作用的最佳靶点。方法:采用全细胞膜片钳技术研究乌头碱、硅巴因对大鼠单个心室肌细胞动作电位时程(APD)、L-型钙电流(ICa)、钠电流(INa)、内向整流钾电流(IK1)以及瞬时外向钾电流(Ito)的作用。结果:乌头碱(1μM)使大鼠单个心室肌细胞90%复极化动作电位时程(APD90)从给药前的150.23±7.02ms延长至236.03±23.22ms(n=8,p<0.01)。ICa在0mV刺激电位下从-727.9±178.0pA增加至-1082.1±222.2pA(n=6,p<0.01);IK1在-110mV刺激电位下从-2122.0±511.1pA增加到-2536.3±386.5pA;乌头碱(1μM)抑制Ito,在+50mV刺激电压下,Ito从3203.6±617.1pA下降到2809.0±547.3pA。同时增加INa。哇巴因5μM使大鼠心肌细胞APD缩短(APD90从86.3±25.2ms缩短至58.9±20.8msn=5,p<0.01),ICa在+10mV刺激电位下从-1326.9±318.9pA减少到-782.3±395.3pA;使Ik1从-1868.3±187.8pA增加到-2392.8±366.7pA(刺激电压-120mV,n=10,p<0.01);使Ito从1272.7±317.6pA增加到1706.6±485.5pA(刺激电压+60mV,n=5,p<0.01)。结论:乌头碱、哇巴因诱发心律失常发生的活性点或最佳靶点是ICa,INa,IK1,Ikr和Iks。APD缩短或过度延长均可致心律失常。

野木瓜注射液镇痛作用的药理机制研究

目的研究野木瓜注射液对背根神经节细胞电压门控性钠通道电流的影响,分析野木瓜注射液阻滞神经传导、产生镇痛作用的药理机制。方法在急性分离的大鼠背根神经节细胞膜上,进行全细胞膜片钳记录,观察10%、25%和50%的野木瓜注射液对电压门控性钠通道电流的影响。结果野木瓜注射液浓度依赖地抑制背根神经节细胞钠通道电流峰值,并影响通道的激活和失活过程。结论野木瓜注射液除影响髓鞘和轴突膜结构外还通过调制初级感觉神经元电压门控性钠通道,影响痛觉信息中枢传入产生镇痛作用。

牛磺酸镁对豚鼠心室肌细胞钾离子通道的影响

目的研究牛磺酸镁(taurine magnesium coordination compound,TMC)对正常豚鼠心室肌细胞钾电流的影响,旨在探讨TMC抗心律失常的作用机制。方法酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录豚鼠单个心室肌细胞IK、IK1的影响。结果应用200μmol·L-1TMC使豚鼠单个心室肌细胞IK在实验电压+70mV时,从给药前(8.67±1.04)pA/pF减少到(6.31±1.16)pA/pF(n=5,P<0.01);TMC对IK1无影响。结论本实验表明TMC具有直接抑制心室肌细胞IK作用,减少IK可能会使动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)延长,这可能是其发挥抗心律失常作用的基础之一。

SO_2衍生物对大鼠神经元和心肌细胞几种离子通道的影响

为了阐明大气污染物SO2对神经系统和心血管系统的毒作用机制,采用全细胞膜片钳技术研究了SO2衍生物(NaHSO3和Na2SO3,分子比为1∶3)对大鼠海马、背根节神经元和心肌细胞膜上钠、钾、钙离子通道的影响.结果显示:(1)SO2衍生物可显著增大大鼠海马CA1区神经元钠电流,不影响钠通道的激活过程,但可使钠电流的失活曲线向去极化方向移动,延迟钠通道的失活过程;另外,SO2衍生物可显著增大瞬间外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK),不影响IA的激活过程,使IK的激活过程向负电压方向移动,促进IK的激活过程,而使IA的失活曲线向正电压方向移动,延迟IA的失活过程.(2)SO2衍生物显著增大大鼠背根节神经元钠电流(TTX-S钠电流和TTX-R钠电流),可使两种钠电流的激活和失活曲线均向去极化方向移动,但对失活的影响大于对激活的影响,即延迟钠通道的失活过程;SO2衍生物显著增大背根节神经元瞬间外向钾电流(TOCs)和延迟整流钾电流(IK),不影响TOCs的激活过程,但可使IK的激活曲线向超极化方向移动,促进IK的激活.另外,还可使TOCs的失活曲线向去极化方向移动,即延迟TOCs的失活.(3)SO2衍生物可显著增大大鼠心肌细胞L-型钙电流(ICa,L),使ICa,L的激活和失活曲线均向去极化方向移动,但对失活的影响大于对激活的影响;SO2衍生物显著增大心肌细胞钠电流,不影响钠通道的激活过程,但可使钠电流的失活曲线向去极化方向移动,延迟钠通道的失活过程;SO2衍生物显著增大心肌细胞瞬间外向钾电流(Ito),使Ito的激活曲线向超极化方向移动,促进Ito的激活过程,但可使Ito的失活曲线向去极化方向移动,延迟Ito的失活过程;此外,SO2衍生物还可显著增大心肌细胞内向整流钾电流(IK1),但不影响其反转电位.结果表明,SO2衍生物可能通过影响神经元和心肌细胞膜上离子通道的活动而对中枢神经、传导神经以及心血管系统产生不利影响.提示大气SO2污染可能与神经系统和心血管系统疾病的发生有关.

急性分离Meynert核团神经元方法及其应用

目的建立急性分离Meynert核团神经元方法。方法切取活脑组织切片,经Protease酶解消化、孵育后,机械分离Meynert核团神经元。作形态学观察,通过单细胞膜片钳技术记录电活动。结果分离出的Meynert核团神经元,倒置相差显微镜下形态保持良好,突起较完整。90%以上细胞可以记录出电活动。结论本方法可以获取活的Meynert核团单个神经元,用于单细胞膜片钳、激光共聚焦、流式细胞术等研究。

孤啡肽对大鼠顶叶皮层神经元延迟整流钾电流的抑制作用

目的研究孤啡肽(orphanin FQ/nociceptin,OFQ/N)对大鼠顶叶皮层神经元延迟整流钾电流(IK)的影响,初步探讨其干扰学习记忆过程的离子机制。方法采用全细胞膜片钳技术,观察OFQ/N对急性分离的大鼠顶叶皮层神经元IK的作用。结果①OFQ/N明显抑制IK,并呈剂量依赖性(P<0.05)。②0.1μmol.L-1OFQ/N使IK的电流-电压(I-V)曲线降低(n=8,P<0.01)。③0.1μmol.L-1OFQ/N使IK激活曲线的半数激活电压(V1/2)和斜率因子(k)分别由给药前的(-43.4±6.1)mV和(11.5±1.1)mV变为给药后的(-19.1±4.6)mV和(17.3±3.2)mV(n=8,P<0.01)。④0.1μmol.L-1OFQ/N使IK失活曲线的半数失活电压(V1/2)和斜率因子(k)分别由给药前的(-68.8±2.6)mV和(16.5±1.7)mV变为给药后的(-76.8±2.8)mV(n=5,P<0.01)和(15.7±3.1)mV(n=5,P>0.05)。结论OFQ/N可抑制大鼠顶叶皮层神经元IK,使IK激活曲线右移,失活曲线左移。