版纳微型猪近交系用于镇痛类经皮吸收药物体外渗透性评价

【目的】通过比较版纳微型猪近交系皮肤(以下简称“猪皮肤”)和人皮肤的组织形态学以及镇痛类经皮吸收药物的体外渗透试验,验证猪皮肤在镇痛类经皮吸收药物评价方面的应用价值。【方法】通过HE染色、Masson染色、弹力纤维染色和透射电镜观察比较2种皮肤组织结构形态;选择水杨酸溶液、双氯酚酸二乙胺乳膏和利多卡因凝胶贴膏3种药物作为模型药物,通过Franz扩散池进行药物渗透试验,采用酶标仪和高效液相色谱仪检测透过皮肤的药物质量浓度。【结果】HE染色、Masson染色以及透射电镜结果显示:猪皮肤与人皮肤的分层和细胞构成相似,但是猪皮肤的表皮层极显著厚于人皮肤表皮层(P<0.01),人皮肤的真皮层极显著厚于猪皮肤真皮层(P<0.01)。版纳微型猪身体各部位皮肤从厚到薄依次是肩胛、臀部、背部和腹部。3种药物渗透的0~24 h内,大部分时间点3种药物透过猪皮肤和人皮肤的药物质量浓度均无显著差异(P>0.05)。【结论】猪皮肤和人皮肤组织结构相似,3种镇痛药物在2种皮肤中的渗透性相似,猪皮肤可用于镇痛类经皮吸收药物的体外渗透性评估。

版纳微型猪近交系心脏的解剖观察

目的 观察中国版纳微型猪近交系心脏的大体解剖和组织学 ,为转基因猪心和异种移植提供形态学基础。 方法 应用灌注固定对 10头版纳微型猪近交系进行大体形态观察 ,测量心脏径线、心壁厚度、心脏的腔室、心脏大血管直径。使用苏木精 -伊红染色进行组织学观察。结果 版纳微型猪近交系心脏外形、各腔室及内部结构等与人心脏基本匹配 ,但是微型猪奇静脉直接开口于右心房 ;组织学观察微型猪心脏各部分结构组成及其细胞种类与人心脏相似 ,但是心肌闰盘较人的少 ,心室内膜下的蒲肯野氏纤维较人的粗大。结论 从解剖形态学及组织学观察 ,版纳微型猪近交系心脏与人心脏形态和结构相似 ,有成为异种移植供体的可能性。

版纳微型猪近交系133家系SLA-DQ cDNA的克隆和序列分析

目的阐明版纳微型猪近交系133家系(BMI-133)免疫相关基因及其可能在猪-人异种器官移植中的作用。方法提取外周血总RNA,通过反转录、cDNA合成及转化,最终获得了具有完整阅读框架的SLA-DQA和SLA-DQBcDNA克隆。结果序列分析表明,所获得的DQAcDNA长度为830bp,编码255个氨基酸残基;DQBcDNA长度为1103bp,编码262个氨基酸残基。结论和其他已报道的小型猪比较,本研究克隆的序列无论在核苷酸还是氨基酸水平上都与之存在差异,由此确定这是BMI-133的两个特有的新等位基因。另外,通过与人的相应序列对比发现,BMI-133与人类相应基因相比具有较高的同源性。随着研究的深入,BMI-133家系极有可能成为供异种器官移植的专用近交系猪群。

成年版纳微型猪近交系克隆猪的制备

本研究以版纳微型猪近交系成年母猪为材料,采用冷胰酶消化法获得成年猪成纤维细胞后,进行细胞的生物学特征检测,研究其作为供体细胞对体细胞核移植效果的影响。结果表明,版纳微型猪近交系成年猪的成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态,细胞冻存前和复苏后存活率分别为97.2%和92.6%(P>0.05),生长曲线呈"S"形,细胞群体倍增时间为36h,体外培养14代后仍能保持正常核型。以其作为核移植供体细胞,核移植重构胚卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数分别为61.9%、13.0%和37枚,移植了重构胚的3头代孕母猪均妊娠,并且有1头母猪产下1头正常的克隆猪。综上所述,利用版纳微型猪近交系成年猪能建立稳定的成纤维细胞系,该细胞系作为核移植供体细胞可获得版纳微型猪近交系克隆猪。

版纳微型猪近交系肾脏的应用解剖研究

目的 了解版纳微型猪近交系肾脏的解剖结构 ,为异种肾移植提供基础资料。 方法 版纳微型猪近交系 2 0头处死后 ,解剖显微镜及游标卡尺检测新鲜及灌注固定的原位和离体肾脏、肾血管及输尿管 ,将肾脏组织标本石蜡包埋行 HE染色。 结果 猪肾脏组织、出入的肾血管及输尿管类似人的相应结构 ,猪肾脏皮质厚度为 (2 0 .0±2 .4) mm,肾动脉平均直径与人髂内动脉直径平均值 5.1 mm相接近 ,所有被测肾均为单支动脉。肾被膜与人肾相似 ,均为纤维层、脂肪层及肾筋膜。左右输尿管直径分别为 5.1 mm和 4.7mm。

版纳微型猪近交系新生猪成纤维细胞的体外培养及其生物学特征研究

试验以版纳微型猪近交系新生猪耳部皮肤组织为材料,采用胰蛋白酶消化法培养成纤维细胞,并对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测。结果表明:版纳微型猪近交系新生猪成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为98.0%和94.07%;生长曲线呈"S"型,倍增时间为33 h;对所制备的染色体核型分析显示2n=38(XY),并在体外培养14代后仍能保持正常核型。本研究建立了稳定的版纳微型猪近交系新生猪成纤维细胞的培养方法,将为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关的研究提供技术基础。

体外培养版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞的生物学特性

目的 分离培养成年版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法 成年版纳微型猪骨髓基质干细胞通过密度梯度离心法分离获得 ,用含 15 %小牛血清的 DMEM在 37℃ ,5 % CO2 条件下培养 ;通过克隆生长特性、特异抗原表达和成骨分化能力鉴定其干细胞特性。结果 版纳微型猪近交系骨髓分离获得的基质干细胞具有多种形状 ,但主要为梭形。其具有很强的增殖能力 ,在体外培养条件下可以观察到明显的克隆样生长 ;表达 SH2、SH3、SH4、SB10和 SB2 1等骨髓基质干细胞的特异标记 ;经成骨添加剂诱导培养之后能分化为成骨细胞 ,碱性磷酸酶活性增强并具有细胞外基质矿化能力。

版纳微型猪近交系RNF4基因克隆、多组织qPCR表达及功能生物信息学分析

RNF4基因调节精细胞分化和增殖过程,文章以Gen Bank下载的猪及近缘物种RNF4 mRNA序列为参考序列,设计特异引物扩增版纳微型猪近交系(BMI)RNF4基因。应用qPCR分析15个重要组织mRNA表达谱,并对蛋白质序列作功能生物信息学分析,构建多物种系统进化树。研究获得BMI RNF4 573 bp编码区序列(Gen Bank登录号:KU705638,对应氨基酸登录号:AOC89056),编码190个氨基酸,蛋白质分子质量(Mw)为21.43 ku,等电点(pI)为6.95。多组织荧光定量表达分析表明RNF4基因在尿道球腺、睾丸、肝、肺中高水平表达;在其他11个组织中呈中低水平表达。功能生物信息学分析表明RNF4蛋白质存在1个保守结构域,无跨膜结构,无信号肽序列;N末端疏水,C末端疏水;有4类功能活性位点,位于细胞核概率为94.1%。系统进化分析表明,BMI与狗亲缘关系最近。结果为研究RNF4基因在猪精细胞分化和增殖方面作用奠定基础。

版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征

以版纳微型猪近交系妊娠47d的胎儿为材料,采用胰蛋白酶消化法消化培养胎儿成纤维细胞,对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测.结果表明,培养的版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后的存活率分别为98.06%和92.12%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为36h;对所制备染色体核型进行分析,显示2n=38,XY,并在体外培养14个代次后仍能保持正常核型.

版纳微型猪近交系精子冷冻保存研究

在版纳微型猪近交系(BMI)公猪精液冷冻保存稀释液中添加不同浓度甘油,并对不同解冻液配方和解冻方法进行研究,对比解冻后的精子活力、质膜完整率和顶体完整率,优化BMI公猪精液冷冻保存方法。结果表明,解冻后,甘油浓度为2%和3%组的精子活力、质膜完整率、顶体完整率显著高于1%、4%和5%组(P<0.05);Ⅰ号解冻液解冻后精子活力、质膜完整率、顶体完整率均显著高于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ号解冻液(P<0.05);在活力、质膜完整率和顶体完整率方面,40℃6s和50℃6s这两种程序的解冻效果都显著优于38℃30s(P<0.05)。由此可见,2%或3%的甘油作为抗冻保护剂、Ⅰ号解冻液解冻、40℃6s或50℃6s水浴解冻是较为理想的BMI公猪精液冷冻保存方法。

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)生长激素受体基因(GHR)序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RTPCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果克隆出了BMI GHR编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示:GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况。方法从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序。并采用半定量RT-PCR方法分析版纳微型猪近交系不同组织中AQP3基因的表达情况。结果成功克隆出AQP3基因编码区全长873 bp的序列,GenBank登录号为HQ888860,其编码290个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛的AQP3基因同源性最大,达99%。多组织半定量RT-PCR研究表明AQP3 mRNA在BMI猪的脾脏、肾脏、肺、小肠中均有表达,其中脾脏中表达最高。结论成功克隆出了版纳微型猪近交系AQP3基因全长编码区,并对其编码的蛋白质功能进行了预测,为进一步的功能研究奠定了基础。

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景:版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。目的:观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。方法:利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。结果与结论:建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103拷贝/μL,线性范围达103～109拷贝/μL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。

版纳微型猪近交系SRY基因编码区序列克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)SRY基因编码区序列并进行分子系统进化研究。方法以看家基因GAPDH为内参,对BMI猪的SRY基因编码区序列进行PCR扩增、克隆和序列分析,并应用Lasergene、Bi-oEdit、ClustalX、MEGA等生物信息学软件同鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹等15个物种相应SRY编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析,在此基础上采用NJ和ME法对其编码区氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果 BMI猪SRY基因编码区序列长711 bp,编码236个氨基酸,GenBank登录号为GU991615。BMI猪与鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹的SRY基因编码区核苷酸序列相似性分别为83.7%、82.8%、78.4%、78.0%、76.9%、73.3%、73.1%、73.0%、72.9%、72.7%、72.7%、72.2%、71.6%、71.3%、70.8%,相应的氨基酸序列相似性分别为72.8%、54.5%、67.3%、64.5%、61.5%、61.9%、59.5%、61.4%、62.0%、59.1%、59.0%、62.0%、59.6%、59.6%、59.2%。结论 BMI猪同鲸鱼等15个物种的SRY基因编码区核苷酸和相应氨基酸序列具有较高的保守性。NJ和ME方法聚类构建的分子系统进化树表明,BMI猪与牛、绵羊、鹿聚为一个分支,符合分类学地位,它们分别为偶蹄目下的猪科、牛科和鹿科动物。

版纳微型猪近交系椎间盘异种抗原α-半乳糖基的分布

目的 探讨中国版纳微型猪近交系 (BMI)椎间盘组织中异种抗原的分布 ,为临床猪 -人异种椎间盘移植提供依据。方法 采用 BMI 6头 ,雄性 ,8～ 11月龄的 L1～ 5椎间盘组织 ,常规福尔马林固定 ,石蜡包埋切片。以植物凝集素 (BSI- B4 )作为亲和物质 ,采用免疫组织化学 SABC方法、DAB显色 ,观察猪椎间盘组织中异种抗原 (α-半乳糖基 )的分布情况。结果 椎间盘纤维环软骨细胞及髓核软骨样细胞核膜有阳性染色的黄色颗粒沉着 ,而基质、弹力及胶原纤维无着色。结论 BMI椎间盘组织中有异种抗原存在 ,但抗原表达较弱 。

版纳微型猪近交系性别决定基因(SRY)原核表达载体的构建及蛋白高效表达

为了构建版纳微型猪近交系SRY的原核表达载体pET-32a(+)-SRY,并通过诱导使其在大肠杆菌中获得高效表达,研究采用添加限制性内切酶位点的引物特异性扩增SRY,连入pMD19-T simple载体,转化入大肠杆菌DH5α,克隆后提取pMD19-T-SRY阳性重组质粒,使用相同的内切酶同时对pMD19-T-SRY质粒和原核表达pET-32a(+)载体进行酶切,连接后使SRY定向克隆到pET-32a(+)表达载体中。经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α,提取质粒后再次转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并通过15%SDS-PAGE鉴定。结果显示,不同浓度IPTG诱导的SRY均在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达。

版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列扩增及生物信息学分析

本试验旨在扩增版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列,为进一步研究DLDH基因的表达信号通路及与精子获能和顶体反应发生相关基因的表达调控提供必要的基础。通过提取版纳微型猪近交系睾丸组织RNA,经反转录后获得cDNA,设计特异性引物以扩增DLDH基因的编码区序列,经测序后采用生物信息学软件对编码区序列及氨基酸序列进行生物信息学分析和结构预测。结果表明,版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列全长1 530bp,编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,不同物种DLDH基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列具有较强的保守性,DLDH蛋白中存在丰富的磷酸化位点,空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。

版纳微型猪近交系成纤维细胞系的建立及冻存方法研究

本试验旨在观察胶原酶对版纳微型猪近交系（Banna mini-pig inbred line,BMI）耳组织的消化效果,探讨不同冻存方法对耳组织成纤维细胞存活率的影响.用胶原酶Ⅳ消化法培养BMI 60日龄仔猪原代耳组织成纤维细胞,建立耳组织成纤维细胞系,比较-80℃条件下分别保存3,5,7,30 d后冻存效果.结果表明：BMI仔猪成纤维细胞具有典型的成纤维细胞特征;生长曲线呈“S”形,倍增时间为37.1h;-80℃冻存3,5,7d的成纤维细胞存活率与液氮保存（93.74％）差异不显著（P＞0.05）,冻存30 d的存活率（79.38％）显著低于其他各组（P＜0.05）,但经48 ～ 72 h培养后仍能贴壁生长.因此,可得出此结论：采用胶原酶Ⅳ消化法可消化BMI耳组织成纤维细胞,而且该细胞在-80℃条件下能进行短期保存.

版纳微型猪近交系生长激素基因克隆及原核表达研究

本研究旨在获得版纳微型猪近交系(BMI)生长激素基因编码区序列,揭示其原核表达规律。采用RT-PCR方法从版纳微型猪近交系(BMI)脑垂体中克隆生长激素(GH)基因,并将其连接到pMD 18-T载体进行测序和生物信息学分析。克隆得到的GH基因cDNA序列长690bp,其中CDS长651bp,编码216个氨基酸,前26个氨基酸为信号肽序列。多猪种GH氨基酸序列比对表明其在各猪种中高度保守,版纳微型猪近交系的GH氨基酸序列与五指山猪和宁香猪的相似性均为100%,与藏猪、香猪、大乌猪、太湖猪、成华猪、内江猪、荣昌猪、长白猪、约克夏的相似性均为99%,与雅南猪、杜洛克的相似性均为98%。扩增GH成熟肽区编码序列,定向克隆至表达载体pET-32a(+),转化入大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达蛋白。SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,重组质粒在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白以包涵体形式存在,分子质量约为40.6ku。以上结果为进一步探究GH基因对BMI矮小性状的影响奠定了基础。

版纳微型猪近交系KITLG基因克隆、组织表达及功能特性分析

【目的】研究KITLG基因在猪生殖细胞发育过程中的作用。【方法】从Gen Bank下载猪KITLG序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)附睾组织中扩增KITLG基因完全编码序列及部分侧翼序列;应用半定量PCR技术检测BMI 10个重要组织的KITLG m RNA转录表达水平,并对KITLG翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测KITLG蛋白质的功能,最后构建KITLG的多物种氨基酸系统进化树。【结果】扩增得到BMI KITLG编码区序列长825 bp,编码274个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KU705624,对应的氨基酸登录号AOC89042。多组织相对半定量表达分析表明:KITLG基因在附睾、心、脾、肺、肾、胃中高表达,在大脑、肝、小肠和睾丸中低表达。功能生物信息学分析表明:KITLG存在1个保守结构域SCF,有1个跨膜螺旋结构,存在N端信号肽序列,N末端和C末端均亲水,二级结构以α螺旋为主,有5类功能活性位点。系统进化分析表明:KITLG在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近。【结论】研究结果为探索BMI KITLG基因在生殖细胞发育过程中的作用及功能奠定基础。