孕期尼古丁暴露对子代小鼠牙釉质形成的影响

目的研究孕期尼古丁暴露对子代小鼠牙釉质形成的影响及其可能的表观遗传学机制。方法通过随机数字表法将10只C57BL/6孕鼠分为对照组(皮下注射生理盐水)及孕期尼古丁暴露(prenatal nicotine exposure, PNE)组(皮下注射尼古丁溶液), 每组5只, 孕鼠生产后分别收集出生后0 d(postnatal day 0, P0;P14、P25含义依此类推)、P14、P25新生小鼠, 根据母代分组分为子代对照组及子代PNE组, 并记录P0、P25子代小鼠体质量。采用显微CT(micro-CT)扫描分析、扫描电镜和维氏显微硬度检测对子代小鼠牙槽骨和下颌切牙进行硬组织相关参数分析。提取P25子代小鼠下颌骨组织及第3代牙上皮干细胞(dental epithelial stem cell, DESC)中的总RNA, 通过实时荧光定量PCR检测成骨向及成釉向分化相关基因、增殖相关标志物和干细胞标志物的表达水平。采用石蜡切片免疫组织化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, Pcna)、釉原蛋白(amelogenin, Amelx)、甲基转移酶ZESTE增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, Ezh2)、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰(histone H3 trimethylated at lysine 27, H3K27me3)阳性染色分布及水平。使用细胞增殖(cell counting kit-8, CCK-8)试剂盒对外源性添加不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)尼古丁以及Ezh2抑制剂GSK126的DESC进行细胞活力检测。结果 PNE组孕鼠较对照组更容易出现不良妊娠结局, P0时子代PNE组小鼠体质量[(0.99±0.02)g]显著低于子代对照组[(1.20±0.04)g](P<0.001);P25时, 子代PNE组小鼠体质量[(9.65±1.32)g]显著低于子代对照组[(15.26±1.70)g](P<0.001), 死产率[(46.40±9.30)%]显著高于对照组(0)(P<0.001)。P14和P25时, 子代PNE组小鼠下颌切牙釉质矿化沉积点与第一磨牙近中面的距离数值[分别为(-1 349±45)、(-506±380)μm]均较子代对照组[分别为(-1 192±147)、(504±198)μm]显著减小(P<0.05, P<0.001), 提示矿化沉积点延迟。子代PNE组小鼠切牙釉柱及釉柱间质较对照组排列松散无序, 显微硬度[(245.7±18.4)MPa]较子代对照组[(371.9±28.7)MPa]显著降低(P<0.001)。HE染色显示子代PNE组小鼠前成釉细胞(pre-ameloblast, Pre-Am)区域排列较对照组紊乱, 矿化沉积点推迟, 暂时性扩增细胞(transit-amplifying cell, TA)及Pre-Am区域延长。免疫组织化学染色显示, 子代PNE组小鼠唇侧颈环(labial cervical loop, LaCL)整体Pcna表达较子代对照组显著增多(P<0.05), H3K27me3较对照组显著富集(P<0.01), 对应区域可见Ezh2表达显著增加(P<0.01), 同时成釉细胞胞质中Amelx阳性信号减弱。体外实验添加1 mmol/L 尼古丁能显著上调子代PNE组DESC的Pcna基因表达水平(P<0.01), 同时显著下调DESC标志物B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1、富亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1和成釉细胞向分化的相关基因Amelx等的基因表达水平(P<0.05, P<0.05, P<0.01)。此外, 与0 h时相比, 干预24 h后1 mmol/L尼古丁可显著增强DESC的增殖活性(P<0.001), 添加10 μmol/L Ezh2抑制剂GSK126可挽救1 mmol/L尼古丁对DESC带来的增殖促进作用。结论孕期尼古丁暴露可能导致成釉向谱系定向分化过程延迟, 致子代小鼠DESC增殖及分化异常, 并且影响H3K27me3表观遗传修饰水平, 造成子代牙釉质发育障碍, 提示孕期尼古丁暴露是牙发育的危险环境因素。