大鼠牙髓干细胞与牙乳头间充质细胞成牙能力的比较研究

目的:探讨采用牙髓干细胞替代牙乳头间充质细胞进行牙齿再生研究的可行性。方法:分别分离培养6周龄SD大鼠切牙牙髓干细胞(DPSCs)和出生1d的SD仔鼠切牙牙乳头间充质细胞(DPMCs),对上述2种细胞的表面标记、增殖能力、体外矿化能力以及向成牙本质细胞分化能力进行比较。结果:DPSCs与DPMCs均具有较强的增殖能力和矿化能力,体外诱导均有成牙本质细胞特异性标记物DSPP基因表达,体内移植后均能够形成牙本质样结构。结论:DPSCs是一种较为理想的牙胚间充质细胞的替代细胞,在适宜的诱导环境中能够替代DPMCs进行牙齿的再生研究。

胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖和分化的影响

背景：研究表明,胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对细胞的增殖分化有重要作用,但对人类牙乳头间充质细胞生物学特性有何影响尚不清楚。目的：观察胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人类牙乳头间充质细胞增殖和分化能力的影响。方法：在建立人类牙乳头间充质细胞培养模型的基础上,①分别用含体积分数为1%或10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将两种生长因子配制成不同的实验终浓度,取第4代生长良好的人类牙乳头间充质细胞,分别加入含0,0.1,1,10,100μg/L碱性成纤维细胞生长因子和0,25,50,75,100μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ的培养基（0μg/L作对照）,培养96h后四甲基偶氮唑盐法测增殖活性。②设10μg/L碱性成纤维细胞生长因子组、100μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子＋胰岛素样生长因子Ⅰ组和对照组。同上述方法每孔分别加含相应质量浓度生长因子的培养液,分别在培养1,3,5,7d后,四甲基偶氮唑盐法测细胞增殖活性,改良酶动力学法测定细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论：在0~100μg/L质量浓度范围时,两种生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖具有促进作用,碱性成纤维细胞生长因子的促增殖作用比胰岛素样生长因子Ⅰ大,联合作用时有协同促增殖作用。碱性成纤维细胞生长因子的最大有效质量浓度为10μg/L,胰岛素样生长因子Ⅰ的最大作用质量浓度为100μg/L。在0~7d时,碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞的碱性磷酸酶活性影响不明显,随时间的增加,胰岛素样生长因子Ⅰ对细胞碱性磷酸酶活性影响增加,与碱性成纤维细胞生长因子联用时,对增加碱性磷酸酶的活性有协同作用。

尼古丁对牙胚、牙乳头间充质细胞BMP分泌影响的体外研究

目的 :探讨尼古丁对体外鼠磨牙牙胚及牙乳头间充质细胞BMP分泌的影响。方法 :分别采用器官和细胞培养的方法体外培养牙胚和牙乳头细胞 ,在培养基和培养液中加入不同浓度的尼古丁 ,将 15d胎龄的胎鼠的下颌第一磨牙牙胚置于对照组和实验组RPMI - 16 4 0半固态培养基表面培养 4d ,人牙乳头细胞置于各组培养液中培养 3d ,之后分别制作常规组织切片和细胞爬片 ,免疫组化染色。结果 :实验组与对照组相比较 ,对照组牙胚和牙乳头细胞BMP阳性染色强于实验组 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 )。结论 :尼古丁对体外培养胎鼠牙胚和人牙乳头细胞BMP的分泌存在抑制作用。

人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的 :观察人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法 :分对照组和实验组 ,对照组是转染不含目的基因的空白质粒 pcDNA3的培养上清 ,实验组是转染pcDNA3 -hDSP重组质粒的培养上清。取第 5代人牙乳头间充质细胞 ,接种于 96孔板 ,对照组 6孔 ,实验组 10孔 ,用MTT法检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响 ,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 :hDSP能明显抑制体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖 (P <0 .0 1) ,但能促进细胞内和培养上清中碱性磷酸酶的分泌 (P <0 .0 1)。结论

甲状旁腺激素对人牙乳头间充质细胞骨形成蛋白3表达的影响

目的 :观察甲状旁腺激素 (parathyroidhormone ,PTH)对人牙乳头间充质细胞骨形成蛋白 3 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)表达的影响 ,探讨PTH对人牙乳头间充质细胞的影响及途径。方法 :细胞培养及原位杂交。结果 :体外培养的人牙乳头间充质细胞BMP3mRNA阳性杂交信号较弱 ;细胞经PTH作用 5d后 ,在细胞质内 ,出现BMP3mRNA阳性杂交信号 ,提示PTH可提高细胞合成BMP3的能力。结论 :在PTH的作用下 ,BMP3基因被激活、表达 ,可能起到类似于牙胚发育早期成釉细胞的作用 ,通过自分泌和旁分泌作用参与牙乳头间充质细胞的诱导和分化 。

小鼠牙乳头间充质细胞自发牙向分化及相关基因表达分析

目的观察小鼠牙乳头间充质细胞在血清培养基中的自发牙向分化,并对其特异性牙向和骨向分化的相关转录因子的基因表达进行分析。方法获取孕16.5 d(E16.5 d)胎鼠的原代牙乳头间充质细胞,分别在含血清培养基和添加白血病抑制因子(LIF)的血清培养基中传代培养,观察细胞是否出现成牙本质细胞表型分化,并检测牙向分化表型和维持未分化表型的细胞的特异性转录因子的mRNA表达情况。结果单纯血清培养基培养的牙乳头间充质细胞可在第4代后自发分化为成牙本质细胞表型;而添加106U/L LIF的含血清培养基,可使小鼠牙乳头间充质细胞的未分化表型稳定至第9代。无论细胞是否出现牙向分化,表现成牙间充质细胞特性的Msx1/Msx2、Pax9、Lhx6/Lhx7均有表达;而成牙本质细胞表型分化后尚能检测到DSPP、Sox9、Cbfα1、Osx等启动向矿化组织细胞终末分化的特异性基因表达。结论牙乳头间充质细胞的自发牙向分化模型可作为诱导其他成体间充质干细胞牙向分化时的阳性对照,其基因表达模式可为研究其他成体干细胞牙向分化后在基因水平上的变化提供佐证。

胶质源性神经营养因子在人牙胚和体外培养的人牙乳头间充质细胞中表达的实验研究

目的 :观察胶质源性神经营养因子 (GDNF)在人牙胚和体外培养的人牙乳头间充质细胞中表达部位及其表达变化。方法 :应用免疫组织化学和免疫细胞化学技术。结果 :GDNF在人牙乳头间充质细胞和人牙胚免疫组化染色呈阳性结果 ,表达位于人牙乳头间充质细胞以及牙胚的成牙本质细胞和前期牙本质细胞层 ,为胞浆内着色 ,呈黄褐色。结论 :GDNF可能参与促成牙本质细胞分化 。

维生素C促进根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶KDM2B和KDM5C表达的研究

目的:研究维生素C是否具有调节根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶相关基因表达的功能。方法:利用不同剂量的维生素C刺激人根尖牙乳头间充质干细胞;采用qRT-PCR(real time reverse transcriptionpolymerase chain reaction,实时定量RT-PCR)在mRNA水平检测组蛋白去甲基化酶相关基因的表达。结果:qRT-PCR结果显示组蛋白去甲基化酶KDM2B(Lysine(K)-specific demethylase 2B)和KDM5C(Lysine(K)-specific demethylase 5C)在10μmol/L维生素C刺激后2、4和8h表达明显升高,其表达升高程度与维生素C的作用具有时依赖性;qRT-PCR结果显示与未刺激组相比,5、10和20μmol/L维生素C在作用8h后都能促进KDM2B和KDM5C的表达,其表达升高程度与维生素C的作用具有剂量依赖性的关系。结论:在根尖牙乳头间充质干细胞中维生素C可以促进组蛋白去甲基化酶KDM2B和KDM5C的表达。

稳定转染EDA基因的人牙乳头间充质细胞的建立

目的建立稳定转染EDA基因的人牙乳头间充质细胞。方法构建EDA真核载体pIRES2-EGFP-EDA,用脂质体将其转染人牙乳头间充质细胞,加G418选择培养液筛选稳定转染EDA的人牙乳头间充质细胞,并采用免疫荧光法鉴定。结果成功构建了EDA真核载体pIRES2-EGFP-EDA质粒,并筛选出稳定转染EDA的人牙乳头间充质细胞。结论EDA基因可以在人牙乳头间充质细胞中得到稳定的表达。

EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学活性及EGFR表达的影响

目的:研究EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学活性及EGFR表达的影响。方法:测定转染和未转染pIRES2-EGFP-EDA的人牙乳头间充质细胞的生长曲线和碱性磷酸酶活性;免疫荧光法观察转染和未转染EDA的人牙乳头间充质细胞EGFR的表达,对荧光照片进行灰度扫描,统计学分析。结果:和未转染者相比,转染EDA的人牙乳头间充质细胞的增殖有轻度减弱,其碱性磷酸酶活性则有显著减弱。正常人牙乳头间充质细胞有EGFR的微弱表达,而转染EDA的人牙乳头间充质细胞中EGFR的表达明显增强。结论:EDA基因对人牙乳头间充质细胞的增殖和活性有抑制作用;这可能与其上调人牙乳头间充质细胞的EGFR的表达有关。

氟对人牙乳头间充质细胞及分泌碱性磷酸酶活性的影响

为了明确氟对人牙乳头间充质细胞和分泌碱性磷酸酶活性的影响 ,体外培养人牙乳头间充质细胞 ,给予不同浓度氟处理 :0 μmol,10 μmol(0 .2× 10 - 6 g/ L) ,5 2 μmol (1.0× 10 - 6 g/ L) ,2 6 3μmol(5 .0× 10 - 6 g/ L) ,1315 μmol (2 5×10 - 6 g/ L) ,2 6 30 μmol(5 0× 10 - 6 g/ L) ,用四唑盐比色法 (MTT法 )测定细胞活力 ,酶联免疫法检测碱性磷酸酶活性 ,结果显示 ,当氟浓度为 2 6 3μmol时 ,培养 2 4 h后 ,细胞活性明显抑制 ,AL P活性无明显改变 ;当氟浓度为 1315 μmol和2 6 30 μmol时 ,培养 12 h细胞活性明显抑制 ,分泌的 AL P活性升高 ,培养 72 h时 2 6 30 μmol氟浓度组几乎无活细胞 ,而AL P活性仍较对照组高 ,由此提示 ,氟作用于人牙乳头细胞时 ,细胞活性与 AL

FGF18对人牙乳头间充质细胞增殖和矿化能力的影响

目的:初步探讨成纤维细胞生长因子18对人牙乳头间充质细胞增殖和矿化能力的影响。方法:采用MTT法和酶动力法检测FGF18对人牙乳头间充质细胞增殖、ALPase活性的影响,茜素红染色检测钙结节形成情况。结果:FGF18刺激人牙乳头间充质细胞48h后,在20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L显著促进细胞的增殖(p<0.01),对细胞的ALP合成无显著性影响(p>0.05),72h后10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L均显著促进细胞增殖和ALP的合成;此外100μg/L和200μg/LFGF18可明显促进细胞钙化结节的形成(p<0.05),结论:FGF18在人牙乳头间充质细胞的分化和矿化过程中可能起着重要的调节作用。

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响。方法成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达。结果结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达。结论同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能。

BMP2介导长链非编码RNA调控牙齿细胞命运

骨形成蛋白2(BMP2)是一种重要的生长因子,在牙齿发育和细胞分化过程中起重要作用。人类和小鼠BMP2基因突变与牙齿发育缺陷呈相关性。长链非编码RNA(IncRNA)是一类长度大于200bp无蛋白编码功能的RNA。大量研究表明IncRNA涉及多种生物过程的调控。本研究旨在探讨BMP2介导IncRNA调控牙乳头间充质细胞谱系演变及牙齿发育的机制。利用构建的Bmp2 floxed/floxed和Bmp2 KO/KO牙乳头间充质细胞株(DMCs),通过RNA测序筛选2种细胞间差异表达的IncRNA并以qRT-PCR证实;快速cDNA末端扩增法鉴定IncRNA的全长序列;原位杂交检测IncRNA的胞内分布;RIP结合质谱分析鉴定RNA-蛋白质间的相互作用;将IncRNA的启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pN2.1,分析BMP2对其启动子活性的影响;构建靶向IncRNA的pLKO-shRNA载体,转染至DMCs以敲减IncRNA的表达。

口腔微生物与免疫学

一氧化氮合酶在兔下颌骨牵张成骨过程中的表达,感染根管中齿垢密螺旋体PCR检测及其与临床症状的关系,热休克蛋白47在糖尿病大鼠皮肤创口愈合过程中的表达,大鼠热休克蛋白47真核表达载体的体外构建,两种漂白方法对离体牙牙釉质表面粗糙度及菌斑粘附能力的研究,EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学活性及EGFR表达的影响.