柚皮苷促进牙周韧带干细胞增殖和分化的研究

目的探讨不同浓度柚皮苷对牙周韧带干细胞增殖和分化的影响。方法分别在含有0.14 mg/mL(低浓度组)和1.4 mg/mL(高浓度组)柚皮苷的细胞培养基上对牙周韧带干细胞进行培养,并与不含柚皮苷的细胞培养基(空白对照组)培养情况进行对比。在培养1 d、4 d、7 d后对牙周韧带干细胞的增殖情况进行测定,在培养7 d、14 d后对牙周韧带干细胞的碱性磷酸酶活性及成骨相关基因[成骨特异性转录因子(Runx2)、骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)]的表达进行测定。结果高浓度(1.4 mg/mL)的柚皮苷对牙周韧带干细胞的增殖具有促进作用(P<0.05),对牙周韧带干细胞的成骨向分化也具有一定的促进作用,能够显著提高成骨相关基因(ColⅠ、ALP、OCN、Runx2)的表达。结论柚皮苷在一定的浓度和时间下,能促进牙周韧带干细胞的增殖与成骨向分化。

2D培养条件牙周膜和牙髓干细胞肌腱或韧带基因表达水平的比较

目的采用酶解组织块法培养牙周膜干细胞(PDLSCs)与牙髓干细胞(DPSCs),分别测定和比较这2种干细胞在2D培养下的肌腱/韧带相关基因(SCX、TNC、TNMD、Six1、Six2、Eya2等)的表达水平的差异。方法运用酶解组织块法培养PDLSCs与DPSCs,通过克隆生长、流式细胞仪检测细胞周期、干细胞表型CD146、STRO-1鉴定、细胞免疫组化检测波形丝蛋白的表达等方式对其干细胞进行鉴定。测定和比较PDLSCs与DPSCs在2D培养情况下的肌腱相关基因标志表达水平的差异,分析PDLSCs与DPSCs在向肌腱组织分化的能力高低。结果DPSCs与PDLSCs相比,表达的Eya2,TNC,Col-I,Col-VI,TNMD基因的水平相近,而低表达SCX基因。结论 2D培养下,PDLSCs比DPSCs可能在向肌腱/韧带细胞转化方面更具优势。

基于p38 MAPK信号通路探讨山柰酚对牙周膜细胞活力、增殖和克隆形成的作用研究

目的 探讨山柰酚在人牙周韧带源性间充质干细胞(h PDL MSC)活力、增殖和克隆形成中的作用及对p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的调控作用。方法 体外培养hPDL MSC细胞系,分为0μmol·L^(-1)、0.01μmol·L^(-1)、0.1μmol·L^(-1)、1μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)山柰酚组,SB203580组,10μmol·L^(-1)山柰酚+SB203580组。分别采用细胞计数试剂盒-8法、5-乙基-2’-脱氧尿苷法、平板克隆法、Western blotting法检测细胞活力、增殖、克隆形成及p38 MAPK通路蛋白水平。结果 药物处理48 h后,与0μmol·L^(-1)山柰酚组相比,0.1μmol·L^(-1)、1μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)山柰酚组细胞活力升高(P <0.05),且细胞形状从细长变成更立方体;药物处理48 h后,与0μmol·L^(-1)山柰酚组相比,0.1μmol·L^(-1)、1μmol·L^(-1)和10μmol·L^(-1)山柰酚组EDU阳性率升高,1μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)山柰酚组克隆形成数增多,10μmol·L^(-1)山柰酚组p-p38蛋白表达升高(P <0.05);与10μmol·L^(-1)山柰酚+SB203580组相比,10μmol·L^(-1)山柰酚组p-p38蛋白水平、EDU阳性率、克隆形成数较高,而SB203580组p-p38蛋白表达、细胞活力、EDU阳性率、克隆形成数较低(P <0.05)。结论 山柰酚可促进hPDL MSC细胞活力、增殖和克隆形成能力,且激活p38 MAPK通路是其分子机制之一。

山柰酚激活p38MAPK信号通路促进人牙周韧带间充质干细胞的迁移和成骨细胞分化

目的:基于p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,探讨山柰酚(KFR)对人牙周韧带间充质干细胞(HPL-MSC)迁移能力和成骨细胞分化能力的影响。方法:体外培养HPL-MSC细胞系,根据细胞处理方式不同,分为0μmol/L KFR组、0.01μmol/L KFR组、0.1μmol/L KFR组、1μmol/L KFR组、10μmol/L KFR组、100μmol/L KFR组、p38 MAPK抑制剂SB203580组(SB203580组)、0.1μmol/L KFR+SB203580组(0.1+SB203580组),药物处理24 h或48 h。药物处理48 h后,进行成骨细胞诱导培养7 d。采用划痕实验、Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,Western blotting评估成骨分化能力和p38 MAPK的活化水平,细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测细胞活力。结果:与0μmol/L KFR组相比,处理24 h后的1μmol/L KFR组细胞活力较高,而100μmol/L KFR组细胞活力较低;处理48 h后的0.01、0.1、1μmol/L KFR组细胞活力较高,而在100μmol/L KFR组细胞活力较低。因此,选择0、0.01、0.1、1μmol/L KFR组做细胞功能分析。与0μmol/L KFR组相比,处理48 h后的0.01、0.1、1μmol/L KFR组细胞迁移率及成骨桥蛋白(OPN)、骨唾液蛋白Ⅱ(BSP-Ⅱ)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、osterix(OSX)蛋白相对表达水平较高,0.1、1μmol/L KFR组侵袭细胞数较多。此外,磷酸化的p38(p-p38)蛋白相对表达水平在0.01、0.1、1μmol/L KFR组显著高于0μmol/L KFR组,在0.1μmol/L KFR组高于0.1+SB203580组,而在SB203580组低于0.1+SB203580组。与0.1+SB203580组相比,细胞迁移率及OPN、BSP-Ⅱ、BMP2、ALP、RUNX2、OSX蛋白相对表达水平在0.1μmol/L KFR组较高,而在SB203580组较低,侵袭细胞数在0.1μmol/L KFR组较多,而在SB203580组较少。结论:KFR能促进HPL-MSC迁移和成骨细胞分化,可能是通过激活p38 MAPK通路实现的。

新型重组人血小板衍化生长因子B腺病毒载体的构建与转染牙周干细胞的研究

目的构建人血小板衍化生长因子B（platelet—derived growth factor—B，PDGF—B）重组复制缺陷型腺病毒载体，使其感染牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）并检测其相关生物学变化。方法采用常规分子生物学方法，构建重组穿梭载体PAdTrackCMV．PDGF—B，用PmeI酶线性化后，线性化质粒在细菌BJ5183内与腺病毒骨架载体质粒AdEasy Ⅰ同源重组，构建重组腺病毒质粒pad-PDGF—B，在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Ad—PDGF—B。Western blotting法检测其在HEK293中的表达情况，同时利用包装好的病毒感染PDLSC，用免疫组化的方法鉴定PDGF—B在细胞中的表达；采用甲基噻唑基四唑（MTY）法检测感染病毒后PDLSC的增殖变化，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测感染后细胞分泌Ⅰ型胶原的变化。结果重组缺陷型腺病毒载体经限制性内切酶酶切分析鉴定，与预期结果一致。重组质粒转染HEK293细胞3d后即可观察到绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）明显表达，Western blotting检测证实PDGF—B表达。重组病毒能够感染PDLSC并表达蛋白，MTT结果显示感染Ad—PDGF—B后的PDLSC增殖能力明显加强。在感染后第4天，感染Ad—PDGF-B后的PDLSC组吸光度值为（0．68±0．02），与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。同时Ⅰ型胶原表达量增高。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达EGFP和PDGF-B的重组复制缺陷型腺病毒Ad-PDGF—B，此病毒能够感染PDLSC并促进其增殖，同时增强Ⅰ型胶原的表达，为牙周病患者牙周组织再生和种植体周韧带重建的基因治疗奠定基础。