小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因敲除载体的构建

目的 :构建用于小鼠牙本质涎磷蛋白基因敲除的载体 ;方法 :PCR获得上、下游两条同源臂 ,将同源臂和正、负双向筛选标志按一定顺序克隆到载体 pBluescript中 ,序列测定确认正确后 ,NotI酶切使载体线性化 ;结果 :载体中各部分的排列顺序与预期一致 ;结论 :获得了小鼠牙本质涎磷蛋白基因敲除的载体 ,为以后的工作打下了基础。

牙本质涎磷蛋白在小鼠牙齿发育中的表达

目的 :通过检测牙胚发育不同阶段牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)的表达情况 ,探讨其在牙齿发育过程中的作用。方法 :采用免疫组织化学染色技术 ,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP的表达。结果 :DSPP的蛋白表达始于钟状中期 ,在内釉细胞和正在极化的成牙本质细胞中表达 ,牙体组织形成开始 ,则转至成牙本质细胞 ,直至牙冠硬组织完全形成。此阶段在成釉细胞有反复表达。牙齿萌出时 ,该蛋白无论在成牙本质细胞还是在成釉细胞表达均为阴性。结论 :DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性 ;它可能在牙冠硬组织的形成 ,牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。

正畸牙根吸收与龈沟液中牙本质涎磷蛋白和牙本质涎蛋白相关性的实验研究

目的探讨大鼠龈沟液中牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质涎蛋白(DSP)的表达与实验性牙移动所致牙根吸收的关系。方法 36只健康Wistar大鼠随机分成3组:对照组、轻力组、重力组。以上颌切牙为支抗,轻力组和重力组分别以0.392、0.98 N力拉右侧上颌第一磨牙向近中移动。加力7 d后,提取龈沟液,制备实验牙及其牙周组织切片,行苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察牙根吸收情况,并通过Western blot检测龈沟液中DSPP、DSP的表达。结果组织学观察:对照组未见明显的牙根吸收,轻力组未见明显的牙根吸收及破牙骨质细胞,重力组在根尖1/3远中区及根分叉附近出现明显牙根吸收。Western blot结果显示:对照组中只有DSPP表达,轻力组和重力组中有DSPP和DSP表达。3组大鼠龈沟液中DSPP、DSP蛋白的表达均有统计学差异(P<0.05),重力组中2种蛋白表达最高,轻力组次之,对照组最低。结论在正畸所导致的牙根吸收过程中,龈沟液中有DSPP和DSP的表达。

早期牙髓损伤修复中牙本质涎磷蛋白表达的免疫组化研究

目的 :初步探讨牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)在早期牙髓损伤修复中的作用。方法 :制备大鼠牙髓损伤模型 ,分别对损伤后 6h、12h ,1d ,2d ,3d ,7d及正常大鼠牙髓标本进行HE和免疫组织化学染色 ,检测各实验组标本中DSPP的表达。结果 :正常大鼠牙髓中仅在成牙本质细胞层有DSPP的阳性着色 ;牙髓损伤后 6h ,12h ,DSPP在成牙本质细胞层的染色明显减弱 ;损伤后 1～ 3d ,染色较正常牙增强。此时 ,牙尖及富细胞区的牙髓细胞也有阳性着色 ;损伤后 7d ,染色与正常对照无明显差异。结论 :DSPP在牙髓损伤的早期阶段表达下调 ;随后在成牙本质细胞及富细胞区牙髓细胞中表达增强 ;7d时表达趋于正常。提示 :它可能在牙髓损伤早期的自身修复中起作用。

小鼠牙本质涎磷蛋白启动子报告基因载体的构建和启动子活性分析

目的 :克隆小鼠牙本质涎磷蛋白 ( dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子 ,构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体 ,在小鼠成牙本质细胞系 MDPC-2 3中分析各种载体中 DSPP启动子活性。方法 :细胞基因组提取 ,PCR、瞬时转染和报告基因检测。结果 :从 MDPC-2 3细胞基因组中克隆出长为1 .5 kbp的 DSPP启动子 ,将启动子酶切成不同的片断 ,克隆到虫荧光素酶报告基因载体 p GL3 -Enhancer,构建出 4种含 DSPP启动子不同片段的报告基因载体 ,将这些报告基因载体瞬时转染至 MDPC-2 3细胞 ,载体中的启动子具有不同的活性。结论 :成功构建了含小鼠 DSPP启动子片段的报告基因载体 ,为以后研究 DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具。

牙本质涎磷蛋白在小鼠牙胚表达的原位杂交研究

目的 :探讨牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)mRNA在牙齿发育过程中的作用。方法 :采用原位杂交技术 ,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPPmRNA的表达。结果 :DSPP在成牙本质细胞的表达始于钟状中期 ,并贯穿以后的各个时期 ;此阶段 ,它还在前成釉细胞及成釉细胞中具有一过性表达。结论 :DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性 ;

牙本质涎磷蛋白反义核酸对体外培养牙胚发育、矿化的影响

目的 :探讨牙本质涎磷蛋白 ( dentin sialophosphoprotein,DSPP)在牙胚发育及矿化中的作用。方法 :胎龄为 1 7d Balb/ c胎鼠上颌第一磨牙 ,对照牙胚置于无血清 BGjb半固定培养基中培养 ;其余牙胚分别置于含有 3 0μmol/ L长 1 5 bp的 DSPP反义或正义寡核苷酸的 BGjb半固体培养基中培养。牙胚体外培养 1 6d后 ,分别进行 HE和 von Kossa检测。结果 :体外培养 1 6d后 ,对照组和正义组牙胚生长良好 ,大小和形态相似。von Kossa染色显示沿牙本质基质走向有明显的矿化线 ;而反义组牙胚体积明显小于对照组 ,且在根方上皮根鞘转折处 ,上皮细胞分化程度低于对照组。von Kossa染色为阴性。结论 :本研究用直接的实验结果说明DSPP反义核酸可以影响牙胚的生长 ,抑制牙胚的矿化。研究证实 :DSPP在牙齿矿化中起着重要作用。同时 ,研究结果还提示 :DSPP在维持牙齿的正常生长中也起着重要的作用。

小鼠牙本质涎磷蛋白5′端非编码区启动子报告基因载体的构建和分析

目的:克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)基因启动子,构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体,在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析各种载体中DSPP启动子活性。方法:PCR、报告基因载体构建、瞬时转染和报告基因检测。结果:PCR获得DSPP启动子的 3个不同片段,将它们克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3 -Enhancer,构建出 3种含DSPP启动子不同片段的报告基因载体,将这些报告基因载体瞬时转染至MDPC-23细胞,载体中的启动子具有不同的活性。结论:成功构建了含小鼠DSPP启动子片段的报告基因载体,为以后研究DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具。

Cbfαl对小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子转录调控作用的研究

目的研究Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子转录活性的影响。方法确定Cbfa1瞬时转染的最高表达时间点后,将含牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的真核表达载体与PCMV5-Cbfαl共转染MDPC-23细胞,分析Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子的转录调控作用。结果MDPC-23细胞转染PCMV5-Cbfαl后,Cbfαl在48h时表达量最高。Cbfa1表达对各段启动子都有激活作用。结论Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子有转录激活的调控作用。

牙本质涎磷蛋白G0代转基因小鼠的获得

目的:构建四环素调控性牙本质涎磷蛋白(DSPP)转基因体系中的受控小鼠系.方法:从质粒pBluescript-DSPP中,将小鼠DSPP编码序列亚克隆到pTRE2的NotI/SalI位点间,构建转基因载体,经酶切鉴定和测序确认后,命名为pTRE2-DSPP;将XhoI酶切线性化的载体DNA纯化后,显微注射到小鼠受精卵的雄原核中,挑选生长状态好的受精卵,移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生3wk后,用PCR及SouthernBlot检测阳性小鼠.结果:注射的受精卵共存活657枚,移卵至28只假孕母鼠后,产仔85只,PCR检测10只为阳性,SouthernBlot检测6只为阳性.SouthernBlot检测阳性小鼠分别传代,开始建系.结论:显微注射方法获得了DSPP转基因受控小鼠的G0代.

RNA干涉法观察成纤维细胞生长因子18对成牙本质样细胞涎磷蛋白表达的影响

目的:通过RNA干涉的方法研究成纤维细胞生长因子18(Fibroblast Growth Factor18,FGF18)对成牙本质样细胞中牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达的影响。方法:RNA干涉质粒pH1-siFGF18瞬时转染成牙本质样细胞MDPC-23,RT-PCR检测FGF18和DSPP的表达,观察FGF18低表达对DSPP表达的影响。结果:瞬时转染RNA干涉质粒后,MDPC-23细胞内FGF18表达明显减少,与此同时DSPP的表达量也明显减少。结论:FGF18可以调控DSPP的表达,影响成牙本质细胞的分化。

TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控

目的:研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因表达中的调控作用。方法:PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体,通过瞬时转染入MDPC-23细胞后,检测报告基因活性。结果:在TGF-β1的作用下,Smad3可以发生转位表达,由细胞浆转入细胞核内。同时,过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用。结论:TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控;在DSPP启动子-2525^+54bp之间,存在TGF-β1/Smad3信号途径的结合位点,从而发挥对DSPP基因的调控作用。

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)过表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)后的形态学改变,并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC,通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC,通过标记基因GFP检测转染效率,观察转染后细胞的形态学改变,RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC,经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42.7%,转染后的细胞出现分化,似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1/2、Pax9、Lhx6/7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化,并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。

小鼠牙胚、软骨组织中牙本质涎磷蛋白基因的克隆

目的 :从小鼠牙胚、软骨组织中克隆牙本质涎磷蛋白基因 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)。方法 :采用RT -PCR方法 ,从小鼠牙胚及软骨组织中克隆DSPP基因片段 ,将所得片段装入载体pGEM -TEasyVector进行序列测定。结果 :从两种组织中均获得 719bp的特异性片段。序列分析表明 ,与已发表的DSPP序列99.7%同源。结论 :成功地从小鼠牙胚、软骨中克隆到DSPP基因部分序列。结果提示 :除牙齿组织外 ,DSPP还可在软骨中表达 。

小鼠牙本质涎磷蛋白基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠牙本质涎磷蛋白编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-DSPP。方法将质粒pTRE2-DSPP中的小鼠DSPP编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-DSPP,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-DSPP经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带DSPP基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,DSPP基因测序鉴定与genebank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/ml。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-DSPP,通过该系统携带的标记基因GFP可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究牙本质涎磷蛋白在牙齿发育中的作用奠定了基础。

人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的 :观察人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法 :分对照组和实验组 ,对照组是转染不含目的基因的空白质粒 pcDNA3的培养上清 ,实验组是转染pcDNA3 -hDSP重组质粒的培养上清。取第 5代人牙乳头间充质细胞 ,接种于 96孔板 ,对照组 6孔 ,实验组 10孔 ,用MTT法检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响 ,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 :hDSP能明显抑制体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖 (P <0 .0 1) ,但能促进细胞内和培养上清中碱性磷酸酶的分泌 (P <0 .0 1)。结论

电化学酶联免疫分析法测定人牙本质涎磷蛋白的研究

目的探讨电化学酶联免疫分析法(ELISA)测定牙本质涎磷蛋白(DSPP)的可行性。方法选取牙本质涎磷蛋白标准品以辣根过氧化物酶(HRP)为标记酶、邻联茴香胺(ODA)为酶催化反应的底物,分别用电化学ELISA法及传统光学ELISA法检测酶催化产物。对比两种检测方法对DSPP检测的线性范围及检测限的差异。结果用电化学ELISA法检测酶催化产物,产物在-0.63 V(vs.Ag/AgCl)有一个灵敏的还原峰,进而可以用于游离HRP的检测,其线性范围为0.04～1.0 ng/mL,检测限为0.01 ng/mL。应用于DSPP标准品的检测,线性范围为2.5～200.0 pg/mL,检出限为2.5 pg/mL,灵敏度显著高于传统光度ELISA检测法。结论电化学ELISA法可以作为检测痕量DSPP的一个新方法。

牙本质涎磷蛋白的研究进展

牙本质涎磷蛋白及其蛋白剪切产物—牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白是在牙本质发育、矿化中起重要作用的非胶原蛋白。关于牙本质涎磷蛋白的结构、功能、表达以及翻译后修饰等均有大量的研究,使之对牙本质涎磷蛋白的认识不断深入。本文就近年来关于牙本质涎磷蛋白的研究现状作一综述。

小鼠牙本质涎磷蛋白在大肠杆菌的表达和纯化

目的：在大肠杆菌中表达牙本质涎磷蛋白，并对重组蛋白进行纯化，为进一步制备抗牙本质涎磷蛋白抗体和功能研究奠定基础。方法：构建ＤＳＰＰ－ ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ 表达载体，重组子以大肠杆菌ＢＬ２１ 为宿主细胞进行诱导表达，表达产物经镍－ 次氮基三乙酸（Ｎｉ－ ＮＴＡ）柱进行亲和层析纯化。结果：工程菌经２０ｈ 诱导后，在ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ上出现一条新的蛋白带，Ｍｒ１０７ ×１０３ 左右，经Ｎｉ－ ＮＴＡ 柱纯化后获得纯度为９５ ％ 的小鼠牙本质涎磷蛋白。结论：获得Ｍｒ １０７×１０３ 的牙本质涎磷蛋白。

人牙本质涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表达

目的 克隆人牙本质涎磷蛋白 (DSPP)成熟肽编码区基因片段并进行原核表达 .方法 用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总 RNA,用 Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头 c DNA,然后利用 PCR法 ,从 c DNA中扩增出人DSPP成熟肽基因片段 (约 6 0 0 bp) ,将所得基因片段插入p Bluescript质粒载体 ,转化到大肠杆菌 XL 1- Blue后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒 DNA,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆 ;将 DSPP基因重组入表达载体 p GEX- 3X中构建表达载体 ,并在大肠杆菌 BL 2 1中进行表达 .结果 酶切图谱和序列分析与国外文献报道一致 ,DSPP蛋白在大肠杆菌中得到表达 .结论 克隆到人 DSPP成熟肽编码区基因片段 ,并在原核中得到表达 ,为进一步研究其功能奠定基础 .