DSPP与BMP-2在牙髓干细胞修复再生牙髓牙本质复合体中的表达及意义

目的 探讨牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)在第三代同质异体牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSCs)再生修复牙髓牙本质复合体后的表达和意义,为年轻恒牙牙髓根尖周疾病提供新的诊疗思路。方法 18只SD大鼠随机分为实验组和对照组,两组均在全麻下摘除大鼠上颌双侧第一磨牙冠髓,实验组同期髓腔定植体外培养的同质异体大鼠牙髓干细胞,对照组冠髓摘除后不进行任何处理,术后均使用玻璃离子充填封闭髓腔。两组动物均于术后2、4、6周处死,取其上颌骨进行免疫组织化学方法检测DSPP和BMP-2的表达。结果 术后2、4、6周时,实验组牙髓牙本质复合体处的DSPP、BMP-2的表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 同质异体牙髓干细胞再植后会增加牙髓牙本质复合体处的DSPP和BMP-2的表达,有助于修复再生牙髓牙本质复合体。

促红细胞生成素对大鼠牙髓损伤后修复性牙本质形成的促进作用研究

目的:探究促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对大鼠牙髓损伤后修复性牙本质形成的作用。方法:分离并鉴定人牙髓细胞(Dental pulp cells,DPCs),将DPCs分为对照(control)组、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)组、TNF-α+EPO组;使用CCK-8法、Transwell法、碱性磷酸酶染色和茜素红染色法检测细胞增殖、迁移、成骨分化能力。将30只大鼠随机分为磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline,PBS)组、氢氧化钙[Ca(OH)2]组和EPO组,对大鼠上颌第一磨牙进行牙髓暴露,分别以含PBS、Ca(OH)2和EPO的胶原蛋白海绵盖髓;术后1个月处死大鼠,micro-CT和苏木精-伊红染色观察修复性牙本质形成;免疫组化染色和Western blot检测牙本质基质蛋白-1(Dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、Osterix(Osx)水平。结果:与control组相比,TNF-α组DPCs增殖、迁移、成骨分化能力降低(P<0.05);与TNF-α组相比,TNF-α+EPO组DPCs增殖、迁移、成骨分化能力提高(P<0.05)。与PBS组、Ca(OH)2组相比,EPO组露髓处形成连续完整的钙化桥及大量修复性牙本质,DMP-1、DSPP、Runx2、Osx水平升高(P<0.05)。结论:EPO通过提高DMP-1、DSPP、Runx2、Osx水平促进牙髓损伤大鼠修复性牙本质形成。

牙本质非胶原蛋白诱导兔修复性牙本质形成的实验研究Ⅰ兔牙本质非胶原蛋白的提取与初步分析

牙本质蛋白具有诱导及促进修复性牙本质形成的作用。本文以１０％ＥＤＴＡ溶液提取兔牙本质非胶原蛋白，应用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳和氨基酸分析系统对其组分、分子量和氨基酸组成进行了分析。

正畸牙根吸收与龈沟液中牙本质涎磷蛋白和牙本质涎蛋白相关性的实验研究

目的探讨大鼠龈沟液中牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质涎蛋白(DSP)的表达与实验性牙移动所致牙根吸收的关系。方法 36只健康Wistar大鼠随机分成3组:对照组、轻力组、重力组。以上颌切牙为支抗,轻力组和重力组分别以0.392、0.98 N力拉右侧上颌第一磨牙向近中移动。加力7 d后,提取龈沟液,制备实验牙及其牙周组织切片,行苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察牙根吸收情况,并通过Western blot检测龈沟液中DSPP、DSP的表达。结果组织学观察:对照组未见明显的牙根吸收,轻力组未见明显的牙根吸收及破牙骨质细胞,重力组在根尖1/3远中区及根分叉附近出现明显牙根吸收。Western blot结果显示:对照组中只有DSPP表达,轻力组和重力组中有DSPP和DSP表达。3组大鼠龈沟液中DSPP、DSP蛋白的表达均有统计学差异(P<0.05),重力组中2种蛋白表达最高,轻力组次之,对照组最低。结论在正畸所导致的牙根吸收过程中,龈沟液中有DSPP和DSP的表达。

人牙本质涎蛋白在人牙胚发育过程中的表达和意义

目的 :探讨人牙本质涎蛋白 (humandentinsialoprotein ,hDSP)在人牙胚发育过程中的表达和意义。方法 :用免疫组化方法检测人牙本质涎蛋白在人牙胚不同发育阶段中的表达。结果 :hDSP在蕾状期、帽状期釉上皮以及钟状早期内釉上皮有弱阳性表达 ,钟状中期正在分泌基质的成牙本质细胞、牙本质小管有强阳性表达 ,钟状晚期 ,牙本质小管仍有强阳性表达 ,而成牙本质细胞转为弱阳性表达。前成釉细胞、成釉细胞有一过性表达。前期牙本质始终无阳性表达。牙胚周围骨组织、软骨组织和口腔软组织无阳性表达。结论 :提示hDSP可能参与了牙本质的形成。另外前期牙本质阴性表达 ,表明hDSP蛋白由成牙本质细胞分泌后 ,可能通过成牙本质细胞突起穿过前期牙本质分泌至矿化前沿 。

牙本质涎磷蛋白在小鼠牙齿发育中的表达

目的 :通过检测牙胚发育不同阶段牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)的表达情况 ,探讨其在牙齿发育过程中的作用。方法 :采用免疫组织化学染色技术 ,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP的表达。结果 :DSPP的蛋白表达始于钟状中期 ,在内釉细胞和正在极化的成牙本质细胞中表达 ,牙体组织形成开始 ,则转至成牙本质细胞 ,直至牙冠硬组织完全形成。此阶段在成釉细胞有反复表达。牙齿萌出时 ,该蛋白无论在成牙本质细胞还是在成釉细胞表达均为阴性。结论 :DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性 ;它可能在牙冠硬组织的形成 ,牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。

牙本质涎蛋白在氟中毒大鼠牙髓组织和牙本质中的表达和意义

目的:研究氟中毒对大鼠牙髓及牙本质表达DSP的影响。方法:选择20只Wistar大鼠,随机分为对照组(饮用自来水,水氟浓度0.16 mg/L)和给氟组(水氟浓度100 mg/L)。3个月后处死大鼠,利用HE染色、免疫组化染色观察氟中毒对牙本质结构和DSP表达的影响。结果:100 mg/L组牙本质生长线明显加重,出现大量球间牙本质。DSP蛋白在牙本质、成牙本质细胞、牙髓细胞中均有不同程度的表达,在牙本质层内侧的成牙本质细胞和牙髓细胞的染色强度2组间无明显区别(P>0.05)。在给氟组,强烈的DSP染色持续出现在前期牙本质层和矿化的牙本质层(P<0.05),表现为加重的生长线。结论:DSP在氟中毒组牙本质中表达明显增强,推测氟可能影响DSP蛋白的降解,影响牙本质的正常矿化。

早期牙髓损伤修复中牙本质涎磷蛋白表达的免疫组化研究

目的 :初步探讨牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)在早期牙髓损伤修复中的作用。方法 :制备大鼠牙髓损伤模型 ,分别对损伤后 6h、12h ,1d ,2d ,3d ,7d及正常大鼠牙髓标本进行HE和免疫组织化学染色 ,检测各实验组标本中DSPP的表达。结果 :正常大鼠牙髓中仅在成牙本质细胞层有DSPP的阳性着色 ;牙髓损伤后 6h ,12h ,DSPP在成牙本质细胞层的染色明显减弱 ;损伤后 1～ 3d ,染色较正常牙增强。此时 ,牙尖及富细胞区的牙髓细胞也有阳性着色 ;损伤后 7d ,染色与正常对照无明显差异。结论 :DSPP在牙髓损伤的早期阶段表达下调 ;随后在成牙本质细胞及富细胞区牙髓细胞中表达增强 ;7d时表达趋于正常。提示 :它可能在牙髓损伤早期的自身修复中起作用。

人牙本质涎蛋白的抗体制备和组织表达研究

目的 :制备人牙本质涎蛋白抗体 ,观察其在不同组织的表达情况。方法 :用原核表达并经过初步纯化的人牙本质涎蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清并用Westernblot法测定效价和检测牙胚和其它组织的蛋白表达。结果 :抗人牙本质涎蛋白抗血清效价可达 1:10 0 0 0 0 ;Westernblot显示牙本质涎蛋白在人牙胚中有表达 ,其分子量约为Mr6 0× 10 3 左右。结论 :牙本质涎蛋白在人牙胚组织中有表达 ,提示其在牙齿发生、牙本质修复和再矿化中可能起重要作用。

c-Jun、c-Fos对人牙本质基质蛋白1基因转录调控作用的研究

目的观察c-Jun和c-Fos对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)基因转录活性的影响。方法将pRSV-c-Jun和pRSV-c-Fos瞬时转染至HDPSCs中,检测转染后不同时间c-Jun、c-Fos蛋白的表达变化。将重组报告基因载体pGL3-P-505～+86与pRSV-c-Jun、pRSV-c-Fos分别共转染至细胞中,报告基因检测系统检测荧光素酶活性变化。结果瞬时转染c-Jun、c-Fos后,蛋白主要表达于HDPSCs细胞胞浆中,并且在转染48h后表达量均达到最高值;c-Jun和c-Fos能够降低pGL3-P-505～+86的荧光素酶活性,c-Jun降低DMP1启动子区-505～+86bp片段的荧光素酶活性更为显著(P<0.05)。结论 c-Jun和c-Fos可降低人DMP1基因转录活性,是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子,DMP1基因启动子序列-110～-100bp区可能是c-Jun、c-Fos有效作用位点。

人牙本质基质蛋白1基因启动子的克隆、测序和活性分析

目的:克隆并测定牙本质基质蛋白1(dentinmatrixprotein1,Dmp1)基因上游启动子的序列,观察其不同片段在人牙髓干细胞(humandentalpulpstemcells,HDPSCs)中的启动子活性,为进一步研究Dmp1基因的转录调控特点和分析特异性转录位点奠定基础。方法:以人全基因组DNA为模板,通过PCR方法获得目的片段,将其连接到PKey-TA载体进行测序,并对所获得的序列进行生物学信息分析。将不同启动子片段构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染至牙髓干细胞,荧光素酶检测启动子活性并进行分析。结果:从人全基因组中获得2.2kb大小的目的片段,测序结果与基因组相应序列吻合。酶切鉴定表明不同长度启动子报告基因载体构建成功。荧光素酶分析结果显示:不同片段的Dmp1启动子在牙髓干细胞中活性不同,-505～-193区为Dmp1启动子的核心启动子区。结论:成功克隆到Dmp1上游启动子的序列,该启动子区在牙髓干细胞中具有活性,为研究Dmp1基因在成牙本质细胞分化和牙本质矿化中转录调控机制奠定了基础。

牙本质涎磷蛋白在小鼠牙胚表达的原位杂交研究

目的 :探讨牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)mRNA在牙齿发育过程中的作用。方法 :采用原位杂交技术 ,观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPPmRNA的表达。结果 :DSPP在成牙本质细胞的表达始于钟状中期 ,并贯穿以后的各个时期 ;此阶段 ,它还在前成釉细胞及成釉细胞中具有一过性表达。结论 :DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性 ;

牙本质基质蛋白1在人不同龋坏牙齿中的免疫定位

目的 :观察牙本质基质蛋白 1(dentalmatrixprotein ,DMP1)在不同龋坏人牙齿中的表达 ,探讨DMP1在牙髓损伤修复中的作用。方法 :采用免疫组化SABC方法观察DMP1在不同龋坏人恒牙中的表达 ,并用图像分析系统进行半定量分析。结果 :DMP1在正常人恒牙组表达阴性 ,浅龋组部分成牙本质细胞和前期牙本质中弱阳性表达 ;中龋组成牙本质细胞数目增多 ,在胞浆和胞突以中阳性表达 ;深龋组成牙本质细胞层排列紊乱 ,出现空泡变性 ,成牙本质细胞样细胞形态细长、扁平 ,两种细胞胞浆和胞突中DMP1表达阳性 ,在修复性牙本质层强阳性表达。与对照组相比 ,成牙本质胞浆中DMP1含量在中龋组和深龋组明显增加 ,浅龋组无显著意义。结论 :DMP1参与成牙本质细胞样细胞分化分泌 。

小鼠牙本质涎磷蛋白启动子报告基因载体的构建和启动子活性分析

目的 :克隆小鼠牙本质涎磷蛋白 ( dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子 ,构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体 ,在小鼠成牙本质细胞系 MDPC-2 3中分析各种载体中 DSPP启动子活性。方法 :细胞基因组提取 ,PCR、瞬时转染和报告基因检测。结果 :从 MDPC-2 3细胞基因组中克隆出长为1 .5 kbp的 DSPP启动子 ,将启动子酶切成不同的片断 ,克隆到虫荧光素酶报告基因载体 p GL3 -Enhancer,构建出 4种含 DSPP启动子不同片段的报告基因载体 ,将这些报告基因载体瞬时转染至 MDPC-2 3细胞 ,载体中的启动子具有不同的活性。结论 :成功构建了含小鼠 DSPP启动子片段的报告基因载体 ,为以后研究 DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具。

牙本质基质蛋白1、骨桥蛋白及骨涎蛋白在小鼠牙骨质形成中的组织学定位

目的:研究牙本质基质蛋白1(dentinmatrixprotein1,DMP1)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)在小鼠成牙骨质细胞分化及牙骨质形成中的时空分布特点。方法:取出生后第5、10、15、25天的BALB/c小鼠36只,引颈处死,解剖分离含下颌第一磨牙区的下颌骨,新鲜配制4%多聚甲醛固定过夜,甲酸-甲酸钠复合脱钙液脱钙1～3周,常规石蜡包埋,近远中向5μm连续切片,免疫组化PV二步法检测DMP1、OPN及BSP的表达。采用CMIAS2000多功能真彩色病理图像分析系统,高倍镜下每张切片阳性部位沿牙骨质表面随机选取不相重叠的10个视野,计算机测量其积分光密度值,取其均值,计为该指标的1个标本的积分光密度值。相同指标重复3次,均值作为该指标在该标本中的表达强度,各指标在不同发育期的积分光密度值采用重复测量数据方差分析,分别进行统计学处理。结果:DMP1、OPN及BSP在小鼠成牙骨质细胞分化及牙骨质形成过程中呈先后不同的时相表达。DMP1表达最早,出生后第5天在牙囊细胞中表达阳性,一旦牙囊开始分化为牙周膜细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞,其表达开始转为阴性;而OPN至出生后第10天出现表达,第15天达到高峰,此后持续表达至牙发育完成的第25天;BSP直到第15天开始表达,持续到第20天后开始减弱,至牙根发育第25天近阴性表达。对3种调节因子的染色积分光密度值的方差分析结果显示:除OPN在第15～25天之间无显著性差异外,其他各因子两两比较差异均具有显著性。结论:牙骨质是由不同序贯发生的多种调节信号顺序启动牙囊细胞分化成牙骨质细胞而形成,DMP1、OPN及BSP在这一过程中先后起着重要的调节作用。

牙本质磷蛋白在人牙胚发育中的原位杂交研究

目的 :观察牙本质磷蛋白 (DPP)基因在人牙胚组织发育过程中的表达 ,探讨其在牙齿发育中的作用。方法 :采用原位杂交的方法 ,检测帽状期、钟状期牙胚组织DPPmRNA的表达。结果 :人牙胚帽状期、钟状早期均未检测到DPPmRNA的表达 ,在钟状晚期前期牙本质形成时成牙本质细胞、前成釉细胞中呈阳性表达。结论 :牙本质磷蛋白基因的转录具有明显的时空特异性 。

BMP-7诱导成牙本质细胞相关蛋白在DPSCs中的研究

目的:检测成牙本质细胞相关功能性蛋白(DSPP、DMP-1、ALP)在BMP-7诱导前后的牙髓干细胞(dental pulp stenl cells,DPSCs)中的表达。方法:采用电镜观察、CCK8和细胞免疫化学染色的方法,观察经100 ng/ml BMP-7诱导后的DPSCs细胞形态、增殖和向成牙本质细胞方向分化的情况。结果:经BMP-7诱导的DPSCs形态无明显变化;BMP-7诱导后第7天细胞增殖比对照组减慢。DPSCs不表达或低表达DSPP、DMP-1和ALP经BMP-7诱导后,DSPP、DMP-1和ALP呈阳性表达。结论:DPSCs经BMP-7诱导后可以向成牙本质细胞方向分化。

牙本质基质蛋白-1及Cbfal在骨与软骨组织内的表达特征研究

目的 :研究牙本质基质蛋白 - 1(Dmp - 1)及Cbfal在骨与软骨组织内的表达特点 ,探讨Dmp - 1在骨形成中的作用及机理。方法 :原位杂交检测小鼠胚胎骨发育过程中 (12 .5dpc至出生后 8周 )Dmp - 1及Cbfal在骨组织中的时空表达谱。PCR法研究Dmp - 1的表达与体外”骨小结”形成及矿化的联系。 结果 :Dmp - 1首先出现在肥大软骨细胞中 ,接着是成骨细胞 ,最后在骨细胞中强烈表达。发育过程中Cbfal和Dmp - 1在软骨和骨中重叠表达 ,且Cbfal在Dmp - 1之先。Dmp - 1的表达与鼠婴颅盖骨细胞内”骨小结”形成及体外矿化关系密切。 结论 :本研究表明Dmp - 1是成骨细胞分化和骨组织形成中的特殊标记基因 ;Dmp -

转化生长因子β1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的影响

目的:观察具有矿化活性的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,HDPSC)在重组人转录生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)作用下对牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,Dmp1)表达和Dmp1基因启动子转录活性的影响。方法:通过建立体外培养的HDPSC矿化诱导模型,经10ng/L重组人TGF-β1刺激后,运用RT-PCR、报告基因检测等方法检测细胞在TGF-β1作用后Dmp1mRNA表达变化以及对pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+862个启动子片段重组报告基因载体活性的影响。结果:诱导矿化后具有部分成牙本质细胞样细胞特征的HDPSC经TGF-β1刺激后,Dmp1mRNA的表达水平明显下降,并存在时间依赖性。pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86相对荧光素酶活性均下降,以pGL3-P-505～+86活性下降更明显,说明TGF-β1具有下调HDPSCDmp1转录活性的作用。计算机分析结果发现,Dmp1基因启动子-505～+86bp区存在多个TGF-β1下游作用分子Smads的结合位点。结论:TGF-β1可下调Dmp1mRNA的表达水平和转录活性,以pGL3-P-505～+86活性下降更明显。启动子-505～-193bp区存在TGF-β1下游作用分子或转录因子的结合位点,从而参与下调Dmp1转录表达过程。

二膦酸盐对骨质疏松大鼠下颌牙槽骨牙本质基质蛋白1表达的影响

目的 :观察二膦酸盐对去卵巢骨质疏松大鼠下颌牙槽骨内破骨细胞以及牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)表达的影响。方法 :取6月龄SD大鼠30只,随机分为假手术组(Sham)、去卵巢模型组(OVX)和二膦酸盐药物治疗组(RIS),每组10只。Sham组大鼠仅术中暴露卵巢不切除,OVX组大鼠行"双侧卵巢切除术+生理盐水皮下注射",RIS组行"双侧卵巢切除术+利塞磷酸钠(2.4μg/kg)皮下注射"。术后3个月取各组大鼠下颌骨常规脱钙,甲苯胺兰染色观察下颌第一磨牙(M1)区域牙槽骨组织学结构,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色观察M1区域牙槽纵隔破骨细胞的骨吸收情况,免疫组化染色观察各组M1牙槽骨DMP1分布表达情况,并进行相关半定量图像分析。结果:与Sham组相比,OVX组TRAP阳性细胞数增加;而较OVX组而言,RIS组TRAP阳性细胞数显著减少(P<0.05)。免疫组化染色显示,各组DMP1不仅表达在牙槽骨骨细胞内,牙槽间隔的松质骨骨基质、牙周韧带中均可见其表达,OVX组M1牙槽骨DMP1表达较Sham组减少(P<0.05),而RIS组表达较OVX组有升高。结论:二膦酸盐能减少骨质疏松大鼠下颌牙槽骨破骨细胞数量,并上调DMP1表达,从而影响下颌牙槽骨矿化。