氟化物对体外器官培养人牙胚细胞增殖及相关调控蛋白表达的影响

目的 观察氟对牙胚细胞增殖及相关调控蛋白表达的影响。方法 采用人牙胚体外器官培养模型 ,组织学观察低浓度 (10mg·L- 1 )和高浓度 (2 5mg·L- 1 )氟对细胞增殖的影响 ;免疫组织化学及图像分析技术检测氟对细胞周期蛋白D1 (cyclinD1 )和细胞增殖核抗原 (PCNA)表达的影响。结果 氟处理组细胞增殖受抑 ,cyclinD1 和PCNA的表达显著降低 (P <0 .0 1)。结论 氟化物可能通过抑制cyclinD1 和PCNA的表达引起细胞增殖抑制 。

不同直径牙胚细胞增殖和骨向分化能力的评估

目的:比较大鼠不同直径牙胚细胞增殖和骨向分化能力的差异。方法:酶消化法分离、培养SD大鼠牙胚细胞,经13μm标准细胞筛分选后获得大、小2种直径的细胞;并分别采用MTT法检测2种细胞的增殖能力;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、茜素红染色法及qRT-PCR检测两者的骨向分化能力。结果:小细胞的增殖能力较低(P<0.05);培养3、7 d后,小细胞组的ALP活性均明显高于大细胞组(P<0.05);培养14 d后,小细胞组钙化结节数量明显高于大细胞组;qRT-PCR检测结果显示,小细胞组中Ocn、Osx、Runx2各矿化相关基因的表达水平均明显高于大细胞组(P<0.05)。结论:牙胚细胞中直径小于13μm的细胞比直径大于13μm的细胞增殖活性低,分化能力强。

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的:探讨牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法:取妊娠12.5dSD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果:面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1)。结论:面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC-CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。

胎鼠牙胚细胞体外培养研究

目的 摸索正常胎鼠牙胚细胞离体培养所需条件 ,为进一步将其作为牙组织工程种子细胞奠定基础。方法 体视显微镜下取 17d龄胎鼠下颌第一磨牙牙胚 ,胶原酶 /分离酶消化 ,以含 10 %胎牛血清 (FCS)的DMEM为培养基进行原代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长特点 ,MTT法测定细胞活性绘制生长曲线 ,取原代培养 4～ 9d的细胞进行组织化学和免疫组织化学染色。结果 倒置显微镜下观察 ,培养细胞在 2 4h内贴壁 ,约 7～ 9d生长连成片状 ,细胞有多角形、大而扁平梭形和长梭形几种形态。生长曲线表明 :培养细胞在前 3天生长缓慢 ,第 4天呈对数生长 ,第 7天达高峰。免疫组化结果表明 :培养细胞来源于两种组织。结论 采用酶消化培养法 ,用胶原做基质饲养层 ,含 10 %FCS的低糖DMEM作为培养基 ,能将胎鼠牙胚细胞培养成活 ,并维持其细胞学特征。

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。

牙胚细胞体外培养过程中成牙基因的表达

背景:多项实验表明牙胚组织在不同的时间点有不同的基因发挥作用,共同促进牙胚发育。目的:观察牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1在大鼠牙胚细胞体外培养的不同时间的表达。方法:对体外培养后第1,3,6天的牙胚细胞提取RNA,反转录后采用实时定量PCR的方法检测牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1mRNA相对表达水平的变化。结果与结论:牙胚细胞中牙本质基质蛋白1、成釉蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达随培养时间的延长而增加,在培养3 d时达到峰值(P<0.05),而同源异型盒基因1 mRNA的表达随培养时间的延长而下降(P<0.05)。

抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用

目的克隆PAK5-N端基因并诱导其表达,进行多克隆抗体制备,为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础。方法根据人全长PAK5cDNA序列,设计引物;利用PCR技术,以PAK5全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因,将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中,经EcoRI/XhoI双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达。利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化,通过免疫家兔制备多克隆抗体,并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论成功克隆了PAK5-N端基因,在E.coli中表达了PAK5-NT,并纯化了GST融合蛋白,制备了PAK5特异性抗体。Westernblotting表明PAK5在牙胚细胞中过度表达,为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。

骨形成蛋白-2和牙胚细胞联合作用诱导人牙周膜干细胞表达成牙骨质细胞的表型研究

目的:探讨大鼠牙胚细胞(Tooth germ cells,TGC)与骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic proteins-2,BMP-2)联合作用对人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)向成牙骨质细胞表型分化的作用。方法:将免疫磁珠法分离的hPDLSCs与TGC共培养,并加入50ng/mL的BMP-2,通过RT-PCR,茜素红染色和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测等方法分析其相关成牙骨质基因及蛋白的表达变化。结果:诱导后hPDLSCs的ALP活性明显升高(P<0.001),牙骨质细胞相关基因如牙骨质附着蛋白(Cementum attachment protein,CAP)、牙骨质蛋白(Cementum protein1,CEMP-1)、ALP,骨钙素(Osteocalcin,OCN)的转录水平表达量均有不同程度的增高(P<0.001)。矿化诱导14d后,诱导组形成大量矿化结节,与对照组相比具有统计学意义(P<0.001)。结论:TGC与BMP-2联合作用能够诱导hPDLSCs与向成牙骨质细胞的表型分化。

OPG及OPGL在牙胚细胞体外培养中的表达及意义

目的:探究OPG及OPGL在牙胚细胞中的表达机制及意义。方法 :采集SD幼鼠的牙胚组织,采用全组织贴壁法培养,免疫组化法检测OPG及OPGL表达。结果及结论:体外培养第3代牙胚组织细胞,均表达OPG及OPGL蛋白,表明在牙胚组织发育过程中,OPG及OPGL参与调控牙体软硬组织发育、成熟及牙齿萌出。

牙胚细胞联合骨髓液及生物工程材料促进牙齿再生的动物实验研究

目的观察牙胚细胞联合骨髓液及生物工程材料促进牙齿再生情况。方法 80只大鼠随机分为四组,实验后收集X线数据、组织学分析结果和免疫组织化学分析结果并加以比较。结果与其余三组相比,试验组大鼠牙齿生长评分情况明显优于假治疗组(P<0.05),差异具有统计学意义。组织学HE染色结果显示20例大鼠均有新生时期细胞的胞浆,18只大鼠的免疫组织化学分析分析结果为阳性。结论牙胚细胞能够重新进入牙生成程序中并参与牙齿的形成,因此这些细胞可以成为牙齿再生的来源。

基于牙胚细胞的组织工程化牙齿研究进展(综述)

牙齿组织工程是近年来口腔医学领域的热点,随着组织工程、材料学、纳米技术和干细胞等技术的发展,在组织工程化牙齿的研制方面已经取得了一些突破性进展,该文就基于牙胚细胞的组织工程化牙齿的研究现状、目前的研究目标等方面作一综述。

猪牙胚细胞条件培养基可诱导人牙髓干细胞的牙向分化

牙源性干细胞的分化受其所处的局部微环境所调控。以往研究表明牙胚细胞条件培养基可诱导牙髓干细胞向成牙的细胞谱系分化。然而，采用人牙胚细胞条件培养基诱导在实际操作中不可行，所以推测异种的牙胚细胞条件培养基可能对人牙髓干细胞产生类似的效应。本研究采用猪的牙胚细胞条件培养基（pTGC-cM）来诱导人牙髓干细胞，评估其诱导前后的细胞形态学、集落形成、体外多向分化、与成牙相关的蛋白和基因表达、体内分化能力等。

海藻酸钙或聚乙烯醇双相陶瓷骨支架与牙胚细胞相容性的研究

目的海藻酸钙或聚乙烯醇(PVA)双相陶瓷骨支架(DCCP)材料在颌骨缺损修复领域应用已久,关于其机械性能及与牙胚细胞相容性的研究,值得深入研究。方法分别制备海藻酸钙或PVA/DCPP支架,分为2组,观测其抗溶解性能、凝固时间、机械力学性能;培养SD大鼠牙胚细胞,分别与2组支架材料复合培养,检测其细胞相容性。结果抗溶解性检测,3%、4%、5%、7%的海藻酸钙/DCCP支架和15%、20%、25%PVA/DCCP支架变形不明显。凝固时间检测,海藻酸钙的最终凝固时间较短。剪切强度检测,PVA/DCCP支架组具备更大的剪切强度,PVA浓度与PVA/DCCP支架剪切强度成正比。扫描电镜观测,海藻酸钙/DCCP和PVA/DCCP支架表面和内部,均形似火山岩状,呈多孔状支架结构。与SD大鼠牙胚细胞复合后,海藻酸钙/DCCP支架细胞相容性较好。结论海藻酸钙/DCCP支架在改进机械性能后,有望应用于组织工程骨或组织工程牙构建领域。

牙胚细胞的分离培养

目的:分离培养牙胚细胞。方法:选择出生后(PN)8天的SD大鼠,从第一磨牙牙胚上撕脱牙囊和成釉器组织,切取牙胚颈部组织,剥离牙乳头组织,分别进行细胞培养,通过差速消化法分离各种牙胚细胞。结果:牙囊、牙乳头、成釉器和上皮根鞘细胞被分离纯化出来。结论:利用差速消化法可同时分离培养4种主要的牙胚细胞。

体外培养的人牙胚上皮细胞的成釉分化

人表皮干细胞可以作为牙齿再生中上皮源性的种子细胞,但是其成釉分化的效率低下.本研究分离培养了人牙胚上皮细胞,利用E13.5的小鼠牙间充质与其重组,构建重组牙胚,对其成釉分化的潜能和机制进行研究.研究结果发现,体外培养的P1代人牙胚上皮细胞成釉率高达50%.随着传代次数的增加,成釉率明显下降.通过对牙上皮发育分化相关基因的表达检测和分析表明,重组牙胚成牙分化能力和成釉潜能的下降与牙上皮发育相关基因的表达状态密切相关.特别是FGF8表达水平的下调以及PITX2不同亚型在人牙胚细胞中表达量的不均衡,可能是导致人牙胚细胞成釉潜能下降并丧失的主要原因.本研究结果为理解牙齿再生过程中上皮源性的种子细胞的成釉机制提供了新的实验数据,对进一步提高表皮干细胞在牙齿再生过程中的成釉率有指导意义.

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

目的利用牙胚细胞(TGC)作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞(DPSC)、外胚间充质干细胞(EMSC)分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白(DSP)的表达和碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7 d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组(P<0.05)。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7 d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著(P<0.05)。共培养组3、7 d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC。

脂肪来源干细胞诱导分化为成牙本质样细胞的体外培养研究

目的:探讨大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs)向成牙本质样细胞分化的可能性。方法:SD仔4只,处死后取腹股沟处脂肪组织。采用细胞体外共培养的方法,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,观察脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。结果:大鼠脂肪来源干细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1)。结论:含有多种细胞因子的TGC-CM能提供较好的微环境,诱导大鼠脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化,能为组织工程牙体再生提供种子细胞来源和微环境选择。

bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究

目的:牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力。方法:取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块+明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色。结果:大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28d形态学观察显示细胞团块+明胶海绵组形成牙样组织。免疫组化:析因分析显示细胞团块+明胶海绵组在5、10、14dDMP-1、BMP-4、DSP表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础。

混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞与支架材料复合成牙的体内研究

目的:研究经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与骨形态发生蛋白2(BMP-2)混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内环境中与不同支架材料复合后的成牙潜能。方法:将取自SD大鼠的BMSCs与牙胚细胞在bFGF和BMP-2混合信号诱导的微环境中共培养后分别接种于明胶海绵和3D打印的PVA/DCCP复合支架材料上,然后回植入同种异体大鼠肾被膜下。在回植后的第1、3、7、14、28天采集回植体样本,用实时定量PCR(RT-PCR)检测各组样本成牙相关基因成釉蛋白(AMBN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ)、以及同源异型盒基因1(DLX1)mRNA水平。结果:各基因在不同时间点的表达量与完整牙胚(E组)均存在统计学差异(P<0.05);上述4个成牙相关基因的表达水平在不同支架材料组之间具有显著性差异(P<0.001);不同成牙诱导信号对各个基因的表达水平也有一定影响。结论:在体内模拟环境下,经bFGF与BMP-2混合信号诱导的大鼠BMSCs与3D打印支架材料复合后能提高成牙基因的表达水平,促进牙体组织的形成。优选支架材料并构建合适的组织工程牙模型对实现非牙胚源性细胞向牙源性细胞的转化同样具有重要意义。

PLGA-磷酸钙盐复合材料的细胞相容性研究

用小鼠E13.5磨牙牙胚细胞作为种子细胞,观察4种生物材料对牙胚细胞的细胞黏附情况及其对牙胚细胞增殖分化的影响.体外实验表明PLGA/HA有利于细胞黏附,体内实验表明PLGA/HA有利于细胞增殖,PLGA/TCP和PLGA/CDHA有利于细胞分化.最终认为PLGA/TCP和PLGA/CDHA的细胞相容性最好,可望成为牙齿再生的生物材料.