釉蛋白在大鼠牙胚釉质发育中的表达特征

目的：观察釉蛋白（enamelin，En）在大鼠牙胚发育过程中的表达，探讨其可能的生物学功能。方法：采用免疫组织化学方法，检测出生后第1，3，7，10，14天SD大鼠第一磨牙牙胚中釉蛋白的表达特征。结果：大鼠出生后第1～14天釉蛋白在成釉细胞中的表达随细胞的分化、基质分泌而变化。釉蛋白在出生后第1天的成釉器前成釉细胞中表达为阴性，但在沿牙尖斜面的进入分泌期成釉细胞中表达阳性；在出生后3天的分泌期成釉细胞胞浆中表达阳性，在刚分泌形成的釉牙本质界呈强阳性表达；在出生后第7天的分泌期成釉细胞胞浆中表达阳性，在未矿化完全的釉质基质中为强阳性表达，且釉蛋白随矿化的程度不同而表达强弱不同；在出生后第10天的大鼠牙胚中釉蛋白仅在成熟期成釉细胞中有较弱的阳性表达，在矿化变薄的剩余釉质基质中仍有阳性表达；在出生后第14天的大鼠牙胚中，釉蛋白表达阴性。结论：釉蛋白由成釉细胞分泌，最初分布于釉牙本质界，位于发育中的釉质全层，随釉质成熟而逐渐减少，至釉质完全形成后而表达停止，提示釉蛋白在釉质形成中可能有重要作用。

釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化、增殖的影响

背景:釉基质衍生物已经在临床上用于治疗严重的牙周炎,发现其可促进牙周组织修复、再生,但其中的机制还未阐明。目的:探讨釉基质衍生物对牙周膜干细胞分化和增殖的作用。方法:分离培养人牙周膜干细胞,检测其克隆形成率、表面抗原表达情况,鉴定其多向分化潜能。将不同质量浓度的釉基质衍生物(20,50或100 mg/L)作用于牙周膜干细胞培养2,4周,用Trichrome和Von Kosa’s染色法检测牙周膜干细胞胶原合成及矿化结节形成情况,Real time RT-PCR方法检测成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素、RUX2的表达,MTT法和生长率法检测牙周膜干细胞的增殖情况。结果与结论:牙周膜干细胞呈梭形,其克隆形成率较牙周膜细胞高,表面抗原CD105,CD29,CD45,CD44的表达率分别为99.8%,99.7%,1.26%,98.8%,具备多向分化潜能。釉基质衍生物呈现一定的时间剂量效应关系促进牙周膜干细胞胶原合成及矿化结节形成,促进成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素、RUX2的表达,促进牙周膜干细胞的增殖,可能在牙周组织修复、再生中发挥作用。

釉基质蛋白对人牙周膜细胞生物学影响的体外研究

目的:了解釉基质蛋白对人牙周膜细胞的增殖、矿化、蛋白合成及超微结构的影响。方法:组织块法原代培养人牙周膜细胞,茜素红染色进行细胞表型的鉴定;采用细胞增殖试剂盒及流式细胞仪检测釉基质蛋白对人牙周膜细胞增殖及细胞周期的影响;BCA蛋白定量试剂盒分析釉基质蛋白对牙周膜细胞蛋白合成的影响;并用透射电镜观察牙周膜细胞超微结构的改变;免疫组化染色观察釉基质蛋白作用下对牙周膜细胞骨涎蛋白和骨桥蛋白表达的影响。结果:釉基质蛋白可促进牙周膜细胞增殖,促进牙周膜细胞DNA的合成,使牙周膜细胞周期的G1期细胞所占百分比降低,而S期细胞所占百分比升高,并可提高牙周膜细胞蛋白总量,透射电镜观察可见经釉基质蛋白作用后的牙周膜细胞胞浆丰富,与蛋白合成相关细胞器粗面内质网及高尔基体发达,釉基质蛋白可促进牙周膜细胞矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。结论:釉基质蛋白能促进牙周膜细胞增殖、蛋白合成及矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达,促进牙周组织的再生。

釉基质蛋白对牙周膜成纤维细胞合成蛋白的影响

目的:检测釉基质蛋白作用下牙周膜成纤维细胞合成蛋白的变化,分析釉基质蛋白促进牙周组织再生的作用。方法:实验于2004-04/08在第四军医大学口腔医院组织工程实验室完成。选取11～14岁儿童因正畸需要拔除的无牙周病及龋病的健康新鲜前磨牙,锐利刀片刮除牙根颈部1/3牙龈及牙周膜,采用全牙胶原酶消化法培养获得牙周膜成纤维细胞,经免疫细胞化学检测证实为外胚间充质细胞。取第3代细胞用于实验,分为2组:对照组为含10mL/L新生牛血清的低糖DMEM培养液,实验组为100mg/L釉基质蛋白,用含10ml/L新生牛血清的低糖DMEM培养液配制。将第3代人牙周膜成纤维细胞制备成密度为1×104/mL的细胞悬液,接种入预先放置有细胞爬片的6孔板中,24h后按实验分组更换诱导液。逐日倒置显微镜下观察细胞形态。第3,7天利用免疫组化方法和图像分析技术检测两种细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、牙骨质附着蛋白的表达。结果:①细胞形态学观察:加入诱导因子初期细胞形态无明显变化,随时间延长,实验组细胞突起逐渐变短,与对照组相比有明显差异。②免疫细胞化学检测结果:对照组骨涎蛋白、骨桥蛋白呈弱阳性到阳性表达,实验组与对照组相比,骨涎蛋白、骨桥蛋白均呈现不同程度胞浆着色加深,与作用时间成正比。对照组细胞骨粘连蛋白基本为阴性表达,而实验组细胞第3天时即检测到了骨粘连蛋白的表达,且随时间的延长染色加深。未经釉基质蛋白处理的牙骨质附着蛋白抗体为阴性表达,经过釉基质蛋白作用第3,7天均检测到牙骨质附着蛋白抗体的弱阳性表达,胞浆着色呈淡棕黄色。设立的空白对照和阴性对照均未见着色。③釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞合成骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的影响:与对照组比较,实验组第3,7天骨涎蛋白和骨桥蛋白均明显上调(184.31±5.67,168.20±6.93;181.42±4.99,163.91±5.86;213.02±5.40,194.81±5.06;211.12±5.59,182.06±6.66;P均<0.01),骨粘连蛋白对照组未表达,实验组第3天时检测到表达;实验组第7天骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白上调幅度均明显高于第3天(163.91±5.86,168.20±6.93,P<0.05;182.06±6.66,194.81±5.06,P<0.01;196.73±5.47,204.67±5.12,P<0.01)。结论:釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞具有上调骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的作用,随时间延长这种促进作用愈明显;并能诱导细胞表达牙骨质附着蛋白。釉基质蛋白在一定浓度下可使人牙周膜成纤维细胞向成骨、成牙骨质样细胞分化。

釉基质蛋白骨诱导作用的实验探讨

目的:观察提取的猪釉基质蛋白是否具有骨诱导作用。方法:采用大鼠腓肠肌肌袋内成骨模型观察釉基质蛋白是否具有骨诱导作用。实验分为2组,采用自体对照,实验组埋入以藻酸丙二醇酯为载体的釉基质蛋白,对照组埋入藻酸丙二醇酯。1个月后处死动物。结果:经大体及组织学观察,大鼠腓肠肌肌袋埋植处瘢痕愈合,未见有骨样或软骨样组织形成。结论:提取的猪釉基质蛋白未具有骨诱导作用。

釉基质蛋白在牙周组织再生过程中对T细胞增殖及其亚群的影响

目的釉基质蛋白具有诱导牙周组织再生的作用,而且釉基质蛋白在同属种类之间具有明显的同源性,并在进化中保持较高的遗传保守性。在体外观察釉基质蛋白对免疫细胞功能的影响,评价釉基质蛋白的免疫原性。方法术前采取10例伴牙周骨缺损的牙周炎患者的外周血淋巴细胞,与4组不同含量的EMPs(对照组为植物血凝素和甲壳素)进行体外培养,分别于3d后检测CD3,CD4,CD8T细胞亚群百分比和CD4/CD8比值,并用MTT法测细胞增殖所得的A值。结果;各组测得的CD3,CD4,CD8T细胞亚群百分比和CD4/CD8比值差异无显著性意义(P>0.05)。淋巴细胞增殖的实验统计结果显示,阳性对照组培养后3d测得的A值与培养前相比差异有显著性意义(P<0.01,t=7.223),其余各组间测得的培养前和培养后的A值的差异均无显著性意义(P>0.05)。结论不同含量的EMPs对淋巴细胞的增殖和T淋巴细胞亚群没有产生明显的影响,釉基质蛋白具有较低的免疫原性,具有临床应用价值。

釉基质蛋白治疗牙周骨下袋缺损促进形成牙周硬组织的能力:数字化标准系列放射学观察

目的:观测分析釉基质蛋白治疗牙周骨下袋缺损前后拍摄的数字化标准系列X线片,以评估釉基质蛋白促进形成牙周硬组织的能力。方法:选择2000-01/2002-01上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科收治的无全身系统性疾病的慢性牙周炎患者24例,共40个牙位。按照牙位随机分为3组,釉基质蛋白组17个牙位,空白对照组13个牙位,甲壳素膜组10个牙位。各组患者在患牙区行改良Widman翻瓣术,釉基质蛋白组骨缺损区根面放置含釉基质蛋白的甲壳素膜,甲壳素膜组放置甲壳素膜,空白对照组不放任何材料仅做术区清创。各组分别于术前和术后6个月测定数字化X影像指标:釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离、釉牙骨质界到骨缺损底部的距离、牙槽嵴顶到骨缺损底部的距离。所有测量值的单位均由Cygnus系统的默认值换算为mm。结果:实验纳入40个牙位,全部进入结果分析。各组各项指标治疗前与治疗后6个月差值的比较:与釉基质蛋白组比较,甲壳素膜组和空白对照组治疗前后釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离差值均有所升高[(0.13±0.28),(0.20±0.41),(0.20±0.35)mm],釉牙骨质界到骨缺损底部的距离、牙槽嵴顶到骨缺损底部的距离差值均明显下降[(1.40±1.16),(0.35±0.56),(0.61±0.72)mm,P<0.05;(1.53±1.17),(0.55±0.79),(0.81±0.76)mm;P<0.01]。结论:釉基质蛋白治疗能够使骨缺损区的骨质修复量及骨缺损深度明显减少,可显著促进牙周骨组织的再生,充分显示了釉基质蛋白治疗牙周骨下袋缺损的优势。

釉基质蛋白对人牙周膜细胞群骨钙素的影响

目的研究人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cell populations,hPDLPs)在釉基质蛋白(em-dogain,EMD)诱导下骨钙素(osteocalcin,OCN)表达的改变。方法组织块法分离培养人牙周膜细胞,实验组用含100 mg/L EMD的培养液诱导6 d,对照组不经EMD诱导培养。免疫细胞化学和实时定量聚合酶链反应(polymer-ase chain reaction,PCR)检测成牙骨质细胞矿化相关蛋白OCN的表达。结果免疫细胞化学结果显示,实验组和对照组hPDLPs细胞胞浆均可见黄色或棕黄色颗粒,OCN表达呈阳性;实验组hPDLPs的OCN检测平均光密度值为0.172 43±0.014 85,对照组为0.167 01±0.017 03,组间差异无统计学意义(t=0.757,P=0.459);实时定量PCR检测结果显示,实验组骨钙素相对表达量是对照组的1.13倍。结论 EMD对hPDLPs的OCN表达无明显影响。

人成釉蛋白抗体的制备及组织表达特异性

目的:制备抗人成釉蛋白抗体,观察成釉蛋白在各组织中的表达。方法:实验于2002-03在解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室完成。以重组、纯化的成釉蛋白C端肽为抗原,混入完全/不完全弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔,经5次免疫后,颈动脉取血,分离血清并用饱和硫酸铵纯化,制备兔抗人成釉蛋白多克隆抗体,用双向免疫扩散试验和ELISA检测抗体的效价。用WesternBlot检测人成釉蛋白的组织表达特异性。结果:①ELISA检测结果:表明兔抗人成釉蛋白多克隆抗体效价达到1∶10000。②WesternBlot显示:成釉蛋白在人牙胚组织总蛋白中有特异性表达,相对分子质量约为65000,在脑、心、肝、脾、肺、肾、胰腺、胸腺、骨骼肌等组织中未见表达条带。结论:制备了抗人成釉蛋白抗体,为研究成釉蛋白在人牙胚中的组织表达以及利用抗体纯化蛋白提供了基础,从蛋白水平证实成釉蛋白为牙胚组织特异性蛋白,并证实人牙胚组织中的成釉蛋白相对分子质量约为65000。

人成釉蛋白C端肽的大量表达及纯化

目的:获得高纯度的重组人成釉蛋白C端肽。方法:实验于2001-01/2004-06在解放军第四军医大学口腔内科实验室解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学实验室完成。①转化pRSET-A/成釉蛋白原核表达质粒入BL21(DE3)细菌进行大量培养,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L,32℃继续振荡诱导培养5h,收集细菌,诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱Ni-NTA结合蛋白,收集洗脱蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。②离子交换层析缓冲液(pH 7.4,50 mmol/L Tris·Cl)平衡Q SapharoseHP层析柱,将初步纯化的蛋白样品加在Q Sapharose HP凝胶介质上,梯度洗脱结合的蛋白,收集洗脱峰,制样,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定洗脱蛋白。结果:①表达重组人成釉蛋白C端肽的金属螯合亲和层析结果:诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱下Ni-NTA结合蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳证实获得初步纯化的重组人成釉蛋白C端肽,其中仍含一些杂蛋白。②重组人成釉蛋白C端肽的离子交换层析结果:获得多个蛋白洗脱峰,聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯化的重组人成釉蛋白C端肽。结论:获得了纯化的人成釉蛋白重组蛋白。

牙胚组织中成釉蛋白表达免疫组织化学和原位杂交的特点

目的:观察人牙胚组织中成釉蛋白的表达特点。方法:实验于2002-02/04在解放军第四军医大学口腔内科实验室完成。取孕5个月流产男性胎儿(产妇知情同意),截取上、下颌骨,常规方法制备人牙胚组织石蜡切片。用兔抗人AMBN多克隆抗体,对人牙胚组织石蜡切片和正常狗牙周组织石蜡切片进行免疫组织化学染色。标记人成釉蛋白cDNA探针,对人牙胚组织石蜡切片进行原位杂交。结果:①免疫组织化学染色发现成釉蛋白由内釉上皮细胞在分化为成熟成釉细胞前开始表达,分泌期成釉细胞高度表达并持续整个釉质形成期,新形成的牙釉质染色阳性;成牙本质细胞在分泌牙本质基质之前开始表达成釉蛋白,在牙本质形成过程中成牙本质细胞持续表达成釉蛋白,呈弱阳性,前期牙本质中呈弱阳性染色;上皮根鞘细胞染色阳性。狗牙周组织染色发现牙骨质表层细胞呈强阳性染色,新形成的牙骨质中可见阳性染色颗粒,呈网状分布。②对人牙胚组织石蜡切片的原位杂交显示,成釉蛋白在成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞中有表达,表达部位与免疫组织化学结果一致。结论:内釉上皮首先表达成釉蛋白,之后前成牙本质细胞达成釉蛋白。成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞表达成釉蛋白。

釉鞘蛋白在小鼠牙胚发育中的时空表达

目的:观察釉鞘蛋白(ameloblastin)在小鼠牙胚发育中表达的时空顺序及分布,探讨釉鞘蛋白在釉质发育矿化中的作用。方法:采用原位杂交的实验方法,观察釉鞘蛋白在牙胚发育的增殖分化期、分泌初期及分泌期的表达。结果:釉鞘蛋白mRNA在成釉细胞增殖分化期表达为阴性,分泌初期细胞内及新生釉基质中开始出现弱阳性表达;至分泌期,细胞内及新生釉基质中均呈强阳性表达。成熟釉质中无釉鞘蛋白mRNA的阳性表达。结论:本实验从分子水平上进一步明确了釉鞘蛋白的时空表达,并推测釉鞘蛋白可能介导了釉质的发育矿化,它与牙齿发育、釉基质矿化反应等过程密切相关。

自体牙周膜细胞和釉基质蛋白修复猴下后牙Ⅲ度根分叉病变

目的:应用自体牙周膜细胞(periodontal ligament call,PDLC)结合釉基质蛋白(enamel matrix derivative,EMD)植入人工制备的猴Ⅲ度根分叉病损内,探讨此牙周组织工程技术治疗重度根分叉病变的可行性。方法:人工制备3只食蟹猴双侧下颌第二双尖牙、第一磨牙和第二磨牙的慢性Ⅲ度根分叉病损。拔除第一双尖牙,分离牙周膜,取体外培养的第3代PDLC再与牛无机矿化骨胶原块复合培养后植入病损内。3只猴的一侧第二磨牙植入PDLC/牛无机矿化骨胶原块+EMD为A组;对侧同名牙植入牛无机矿化骨胶原块+EMD为B组;一侧第一磨牙植入PDLC/牛无机矿化骨胶原块为C组,对侧同名牙植入牛无机矿化骨胶原块为D组;一侧第二双尖牙置入EMD为E组;对侧同名牙为空白对照组(F组)。所有部位均覆盖胶原膜,每组3颗牙,分别于植入材料前和植入后6个月记录牙颊舌侧根分叉部位的牙周袋探诊深度(periodontal depth,PD)和附着水平(attachment level,AL),拍摄X线片。结果:植入材料后6个月,除少数根分叉暴露的病损外,多数根分叉处的PD和AL有不同程度的改善,依次为E组和F组(第二双尖牙),A组,C组,B组和D组。修复的牙槽骨几乎充满第二双尖牙的根分叉,甚至可见较清晰的骨硬板,其他牙位的牙槽骨虽有一定程度的修复,但在缺损的冠方仍留有较明显的密度减低影。结论:PDLC和EMD均可增加Ⅲ度根分叉病变区牙周组织的修复,两者联合应用效果更好。Ⅲ度根分叉病变的治疗效果不仅取决于植入的细胞和材料,而且受多种因素的影响,尤其是根分叉的大小和牙龈瓣能否很好覆盖病损是影响愈合的重要因素。

小鼠重组釉蛋白基因稳定表达细胞系的建立

目的:构建小鼠重组釉蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系。方法:取初生小鼠牙胚组织,提取RNA,用RT-PCR技术扩增釉蛋白基因片段,经双酶切后克隆至真核表达载体pcDNA3.1TM/myc-His(-)B上,转化大肠杆菌E.coli DH5α,中提质粒,将该重组表达质粒转染至HEK 293A细胞,用G418筛选出阳性克隆,并检测釉蛋白的表达水平。结果:通过测序表明,小鼠釉蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上。将该表达系统转染HEK 293A细胞后,进行Western Blot检测,证明其中有相对分子质量约32000的釉蛋白表达。结论:成功构建了小鼠重组釉蛋白真核表达载体,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础。

转录因子Sp3与釉蛋白基因转录调控关系的研究

目的 探讨转录因子Sp3对釉蛋白基因（enamelin）的转录调控作用,以明确Sp3是否直接参与了釉蛋白基因的转录调控.方法 采用生物信息学软件预测釉蛋白基因上游调控区含有Sp3的结合位点;运用凝胶阻滞实验检测牙胚中的Sp3蛋白与釉蛋白调控区Sp3识别序列间的结合能力及其特异性;采用体外基因重组技术和双荧光素酶报告分析,将釉蛋白基因5＇调控区构建至pGL3-basic载体中,并将其与Sp3表达质粒体外共转染至永生化成釉细胞株（LS8）中,检测Sp3对釉蛋白基因的激活.结果 凝胶阻滞实验与双荧光素酶报告分析结果显示,Sp3不能直接结合在釉蛋白上游调控区并激活其转录.结论 Sp3没有以直接作用的方式参与釉蛋白基因的转录调控.

X染色体Amelogenin等位基因缺失的研究

目的 探讨采用Amelogenin基因常规Sullivan106／112bp体系进行性别鉴定时X染色体Amelogenin等位基因片段（Amel-X）缺失的原因以及缺失后对法医物证性别鉴定和临床疾病诊断的影响。方法 采用Sullivan212／218bp和Haas-Rochholz80／83bp引物体系对Amel-X缺失的样本进行验证，并对缺失的Amel-X进行序列分析。结果 采用Sullivan212／218 bp和Haas-Rochholz80／83bp引物体系分型时均可重获缺失的等位基因。测序分析在Sullivan106／112 bp体系的正向引物结合区检出3种点突变，包括分别位于3’端第2位、第13位的单点突变以及第2位和第13位同时发生的杂合多点突变。结论 引物结合区点突变导致的无效扩增是Amel-X等位基因缺失的原因，这在实践中会干扰性别鉴定，需引起重视。